Free Press

Resultados y discusión

Se ha informado que la conjugación de Spirogyra se induce mediante la disminución del contenido de nitrógeno o su agotamiento (Grote 1977; Yamashita y Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Por lo tanto, primero intentamos inducir la conjugación agotando el nitrógeno del medio de cultivo. Sin embargo, esto no tuvo éxito. Grote (1977) informó de que la conjugación se inducía en un medio de closterio inorgánico puro y que el valor del pH era importante. Aunque incubamos los filamentos de algas en el medio de varios pH, no se indujo la conjugación. Además, otros ensayos, varias temperaturas y el agotamiento de varios nutrientes, no tuvieron éxito. Se ha informado de que la conjugación se indujo incubando filamentos de algas bajo iluminación continua en algunas especies de Spirogyra (Yamashita y Sasaki 1979). Sin embargo, nuestros materiales no mostraron conjugación, incluso cuando los filamentos fueron incubados sin fuente de nitrógeno bajo iluminación continua durante 2 semanas. Después de varios ensayos anteriores, finalmente conseguimos inducir la conjugación incubando los filamentos en una placa de agar preparada con APW a 23°C bajo un ciclo L-D de 12:12 horas durante 4 días. Durante la incubación también se formó un rizoide en forma de vara en el extremo distal de las células terminales. Cuando los filamentos en la placa de agar se incubaron en la oscuridad, no se indujo el fenómeno de conjugación. Allen (1958) informó de que la conjugación era inducida por la incubación en placa de agar. Mantuvo un cultivo madre utilizando el medio suelo-agua de Pringsheim (Pringsheim 1946) bajo un régimen de 16 h de luz (tubo fluorescente blanco frío) y 8 h de oscuridad a unos 20°C. Para inducir el apareamiento, se transfirieron varios filamentos a agar Difco al 1,5% preparado con agua destilada y se incubaron a unos 20°C bajo un ciclo L-D de 16:8 h. Tras la incubación durante unos días, se formaron zigosporas en la placa de agar. Aunque las condiciones de luz y la temperatura durante la incubación eran diferentes, el método de Allen (1958) era fundamentalmente igual a nuestro método. Analizamos además los factores responsables de la inducción de la conjugación en la placa de agar, como se indica a continuación.

Nos preguntamos si algún contaminante(s) desconocido(s) contenido(s) en el polvo de agar era responsable de la inducción de la conjugación. Examinamos esta posibilidad mediante el siguiente experimento. El polvo de agar (Wako, Osaka, Japón) se suspendió en APW y se mantuvo a 4°C bajo agitación durante la noche. Tras la centrifugación (185×g, 10 min), el pellet resultante se lavó 2 veces con APW por centrifugación. El pellet de agar final se suspendió en APW fresco y se prepararon las placas. La conjugación se indujo con éxito en esta placa de agar. Cuando los filamentos de algas se incubaron en el sobrenadante obtenido al lavar el polvo de agar, la conjugación no se indujo en absoluto (datos no mostrados). Así pues, la incubación en la placa de agar, pero no el contaminante soluble, fue la responsable de la inducción de la conjugación.

Dado que el APW no contenía productos químicos nitrogenados, la placa de agar no debería contener nada o muy poco nitrógeno. Por lo tanto, era posible que ambos factores, la ubicación en la placa de agar y el agotamiento del nitrógeno, actuaran sinérgicamente en la inducción. Para examinar esta posibilidad, incubamos filamentos en una placa de agar preparada con APW suplementada con 1 mM de KNO3. En esta placa de agar, la conjugación también fue inducida (Fig. 1a), indicando que el agotamiento del nitrógeno no es responsable de la inducción de la conjugación. Además, la conjugación fue inducida cuando los filamentos fueron incubados en una placa de agar preparada con medio closterium, que contenía varios nutrientes (Fig. 1b). Estos resultados indicaron inequívocamente que la ubicación en la placa de agar per se es un factor responsable de la inducción de la conjugación.

La inducción de la conjugación en placa de agar se examinó en otra especie, S.fuluviatilis, que diferenció el rizoide al cortar los filamentos de las algas (datos no mostrados) como en el caso de S. castanacea. En esta especie, la conjugación también se indujo tras la incubación en una placa de agar preparada con APW. Examinamos además la conjugación en placa de agar en tres Spirogyra, que no diferenciaban el rizoide. S.ellipsospora Transeau se ha mantenido en el laboratorio como contaminante del cultivo de Chara. Otras dos Spirogyra sp. recogidas en el lago Biwa se mantuvieron como cultivo axénico durante 6 meses. Las tres Spirogyra no mostraron conjugación por incubación en placa de agar.

En algunas especies de Spirogyra, la conjugación fue inducida por la disminución o el agotamiento del contenido de nitrógeno (Grote 1977; Yamashita y Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Además del contenido de nitrógeno, la intensidad de la luz y/o el pH tuvieron que ser controlados en S. majuscule (Grote 1977). En S. castanacea y S.fuluviatilis, la incubación en placa de agar fue eficaz y no fue necesario agotar el nitrógeno (presente estudio). Por otra parte, Agrawal y Singh (2002) informaron de que Spirogyra sp. no iniciaba la conjugación en la placa de agar al 2-10%. Esto fue similar a nuestros resultados obtenidos en Spirogyra sp., que no diferenció el rizoide. Así pues, los factores necesarios para la inducción de la conjugación son muy variables entre las especies de Spirogyra. Nos preguntamos si la inhibición del crecimiento era responsable de la inducción de la conjugación en la placa de agar. Durante la incubación en la placa de agar preparada con el medio APW o con el medio closterium, las células proliferaron mediante la división celular en ambas placas de agar cuando las células no iniciaron la formación de la papila del tubo de conjugación. Así pues, la inhibición del crecimiento no fue un factor desencadenante de la conjugación.

Para examinar la presencia del tipo de apareamiento entre filamentos, se sometió el cultivo monoclonal de S. castanacea a la inducción de la conjugación. Tras 48 h de incubación, se encontraron dos tipos de conjugación en el mismo filamento (Fig. 2a-c). La figura 2b muestra las células que inducen la conjugación escalariforme (punta de flecha en la Fig. 2a). Por otro lado, la Fig. 2c muestra las células inducidas por la conjugación lateral (flecha en la Fig. 2a). Las cigosporas se formaron normalmente después de la conjugación lateral (Fig. 2d). Yamagishi (1977) informó que la conjugación escalariforme se observa generalmente, mientras que la lateral era rara en S.castanacea. Nuestro resultado es consistente con el de Yamagishi (1977). Sin embargo, dentro del límite de nuestros conocimientos, la inducción de conjugaciones escalariformes y laterales en un mismo filamento (Fig. 2a) es el primer informe. Cuando dos filamentos se emparejaron, todas las células de un filamento se comportaron como masculinas y las del otro filamento lo hicieron como femeninas en la mayoría de los casos. Sin embargo, muy raramente se formaron zigosporas en ambos filamentos (Fig. 3). Por tanto, el tipo de apareamiento no es fijo al menos en S.castanacea. El hipnozigoto se formó por incubación en la placa de agar durante aproximadamente 1 mes. Sin embargo, fue difícil inducir la germinación de forma reproducible añadiendo el medio closterium a los mismos. Debe encontrarse un método para inducir la germinación de forma reproducible.

Examinamos la identificación de los materiales extracelulares secretados durante el proceso de apareamiento utilizando varias lectinas en S. castanacea. Entre las 19 lectinas examinadas (BSL-I, BSL-II, Con A, DBA, DSL, ECL, jacalin, LEL, PHA-E, PHA-L, PNA, PSA, RCA I, SBA, SJA, STL, UEA I, VVL y WGA), BSL-1, Con A, jacalin, RCA-I y SBA tiñeron las células reproductivas pero no las vegetativas (Tabla 1). Yoon et al. (2009) informaron de que tres lectinas, Con A, RCA y UEA, mostraron un etiquetado considerable en materiales extracelulares en S. varians (Hassall) Kützing. Por lo tanto, los materiales de unión a la lectina secretados durante la conjugación parecen ser diferentes en cierta medida entre las especies. Anteriormente informamos de que BSL-I y jacalin mostraban patrones de tinción contrastados en el rizoide: jacalin teñía claramente el contorno del rizoide, mientras que la tinción con BSL-I era difusa (Inoue et al. 1999, Ikegaya et al. 2008b). Se sugirió que el material de unión a BSL-I era responsable de la adhesión de los filamentos al sustrato. Por otro lado, se especuló que el material de unión a la jacalina estaba implicado en el reconocimiento del sustrato (Ikegaya et al. 2008b). En el presente estudio, por tanto, centramos nuestra atención en BSL-I y jacalina (Fig. 4). Tras 48 horas de incubación en placa de agar, un filamento mostrado en la Fig. 4a formó papilas en varias direcciones. Se especuló que este filamento inició la formación de papilas en ausencia del filamento asociado. El BSL-I tiñó fuertemente la superficie de las papilas. Los septos entre las células también se tiñeron fuertemente. A continuación, teñimos un par de filamentos que empezaron a conjugarse tras 48 horas de incubación. En la Fig. 4b, se juzgó que el filamento superior era un gameto masculino y el inferior un gameto femenino, respectivamente, ya que el diámetro de las células inferiores del filamento era mayor que el del filamento superior. Los tubos de conjugación alargados de las células emparejadas estaban fuertemente teñidos, mientras que toda la superficie celular del gameto femenino estaba débilmente teñida (Fig. 4b′). Tras 72 horas de incubación, toda la superficie celular del gameto masculino también se tiñó débilmente (Fig. 4c′). Tras 96 horas de incubación en placa de agar, se formaron zigosporas (Fig. 4d). Los tubos de conjugación se tiñeron fuertemente (Fig. 4d′), mientras que la superficie de las zigosporas no se tiñó. A continuación, se examinó la tinción con jacalina. Las células de los filamentos de la Fig. 3e formaron papilas en la misma dirección. Especulamos que este filamento inició la conjugación en presencia de un filamento asociado y se perdió durante la transferencia al vidrio del portaobjetos. Las papilas se tiñeron fuertemente con jacalina (Fig. 4e′). A lo largo del proceso de conjugación, la jacalina tiñó principalmente los canales de conjugación (Fig. 4f′-h′). También se examinó el patrón de tinción con Con A, RCA-I y SBA (datos no mostrados). Con A tiñó fuertemente los septos entre la zigospora formada en el gameto femenino, mientras que las papilas lo hicieron muy débilmente. Cuando se formaron zigosporas, el patrón de tinción con RCA-I o SBA fue similar al de BSL-I, como se muestra en la Fig. 4d′.

Examinamos el efecto de seis lectinas, BSL-I, Con A, jacalina, RCA-I, SBA y WGA, sobre la conjugación. Los filamentos se preincubaron en APW suplementado con cualquiera de las lectinas durante 1 día. A continuación, se transfirieron a una placa de agar suplementada con la misma lectina y se incubaron durante 4 días. Se comprobó que la jacalina inhibía gravemente la formación de zigosporas, pero las otras no (datos no mostrados). El análisis sistemático mostró que la jacalina inhibía severamente el paso del comienzo mismo; el inicio de la formación de la papila (Fig. 5). A continuación, se examinó la reversibilidad de la inhibición por jacalina. Los filamentos se incubaron sucesivamente en APW suplementado con jacalin durante 1 día y luego en APW sin jacalin durante 1 día. A continuación, se incubaron en una placa de agar sin jacalina durante 4 días. Sin embargo, no se formó ninguna papila. Esta inhibición irreversible podría ser causada por la fuerte unión de la jacalina. Yoon et al. (2009) informaron de que el RCA y la UEA inhibían la conjugación. Sin embargo, no identificaron el paso de la inhibición. Aunque BSL-I, RCA-I, Con A y SBA también tiñeron el tubo de conjugación, no inhibieron su formación. El papel de los materiales reconocidos por BSL-I, RCA-I o SBA es el objetivo de futuros estudios.

Randhawa (1959) sugirió la similitud de los procesos de conjugación y la formación de rizoides: el estímulo de contacto está involucrado. Por otro lado, Kniep (1928) creía que los procesos de conjugación se debían esencialmente a un estímulo químico (citado en Randhawa (1959)). Tanto el tubo de conjugación como el rizoide se inician mediante la formación de la papila y pueden alargarse mediante el crecimiento de la punta. Sin embargo, el tubo de conjugación se forma en el flanco pero el rizoide se forma en el extremo distal de la célula (Nagata 1973). La jacalina tiñó claramente el contorno tanto del tubo de conjugación (Fig. 3e′-h′) como del rizoide (Ikegaya et al. 2008b). La jacalina no inhibió la formación del rizoide, pero sí la diferenciación hacia el rizoide en forma de roseta (Ikegaya et al. 2008b). Sin embargo, en el caso de los tubos de conjugación, la jacalina inhibió la formación de la papila per se (Fig. 5). Parece que el papel del material de unión a la jacalina es diferente en el tubo de conjugación y en el rizoide.

El éxito en la inducción reproducible de la conjugación en el laboratorio abrió un camino para el análisis sistemático de la conjugación en Spirogyra, como el mecanismo de determinación de la sexualidad de las células, el papel de los materiales de unión a la lectina, el mecanismo de movimiento del protoplasto masculino.