La gran mayoría de los procedimientos de IHC/ICC emplean la fijación de tejidos y células utilizando fijadores a base de formaldehído. El protocolo siguiente describe la técnica para generar una solución de formaldehído al 4% en PBS. El fijador más eficaz debe determinarse experimentalmente.
Precaución: El formaldehído es tóxico. Por favor, lea la MSDS antes de trabajar con este producto químico. Deben usarse guantes y gafas de seguridad y las soluciones deben hacerse dentro de una campana de humos.
Por favor, lea el protocolo en su totalidad antes de empezar.
Reactivos necesarios
- H2O desionizado
- HCl (diluido)
- NaOH (1 N)
- Paraformaldehído en polvo
- 1X PBS: 0,145 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0081 M Na2HPO4, 0,0015 M KH2PO4, pH 7.4
Materiales
- Unidades de filtrado
- Cristalería y barra de agitación (dedicada a la solución de formaldehído)
- Guantes y protección ocular
- Placa caliente con agitador magnético
- Termómetro
- Capucha ventilada
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Procedimiento
- Para 1 L de Formaldehído al 4%, añadir 800 mL de PBS 1X a un vaso de cristal sobre una placa de agitación en una campana ventilada. Calentar mientras se agita hasta aproximadamente 60 °C. Tenga cuidado de que la solución no hierva.
- Agregue 40 g de polvo de paraformaldehído a la solución de PBS calentada.
- El polvo no se disolverá inmediatamente en la solución. Aumente lentamente el pH añadiendo 1 N NaOH gota a gota con una pipeta hasta que la solución se aclare.
- Una vez disuelto el paraformaldehído, la solución debe enfriarse y filtrarse.
- Ajuste el volumen de la solución a 1 L con 1X PBS.
- Compruebe el pH, y ajústelo con pequeñas cantidades de HCl diluido hasta aproximadamente 6.9.
- La solución puede alicuotarse y congelarse o almacenarse a 2-8 °C hasta un mes.
La diferencia entre paraformaldehído, formaldehído y formalina
El paraformaldehído (cuyo nombre químico es polioximetileno) es un polvo de formaldehído polimerizado que por sí mismo no puede fijar tejidos. Para poder utilizarlo como fijador de tejidos, el paraformaldehído debe disolverse en agua caliente para convertirse en una solución de formaldehído. La formalina es una solución saturada de formaldehído en agua (37% en peso, 40% en volumen) que contiene un 10-15% de metanol. El metanol se añade para ralentizar la polimerización a formaldehído, lo que reduce el poder de fijación de la formalina. La formalina también puede fabricarse en una forma sin alcohol a partir de paraformaldehído en polvo.