Vous êtes à l’aéroport en train de brûler du temps avec un rapport à rendre demain matin pour votre professeur. Vous avez vos données. Pourquoi ne pas profiter de ce temps et calculer le changement de pli d’expression pour les gènes que vous avez testés dans cette première expérience de qPCR que vous avez faite la semaine dernière ?
C’est facile – je vais vous montrer comment.
Vérifiez votre méthode
Il existe deux méthodes principales pour analyser les données de qPCR : l’analyse Ct double delta et la méthode de la courbe standard relative (méthode Pfaffl). Les deux méthodes font des hypothèses et ont leurs limites, donc la méthode que vous devriez utiliser pour votre analyse dépendra de votre conception expérimentale.
L’analyse du double delta Ct suppose que :
- il y a une efficacité égale des amorces entre les ensembles d’amorces (c’est-à-dire. à 5% près);
- il y a une efficacité d’amplification proche de 100% pour les gènes de référence et les gènes cibles;
- les gènes de contrôle interne sont constamment exprimés et ne sont pas affectés par le traitement.
La méthode s’adresse généralement aux expériences avec un grand nombre d’échantillons d’ADN et un faible nombre de gènes à tester.
La méthode de la courbe standard relative suppose que :
- il y a des efficacités égales entre le contrôle et les échantillons traités.
Cette méthode fonctionne mieux si vous avez moins d’échantillons d’ADN mais un plus grand nombre de gènes à tester.
Ce dont vous avez besoin pour l’analyse Ct double delta
- Valeurs Ct de la qPCR (données brutes) pour :
- le gène d’entretien : conditions de contrôle et expérimentales ;
- le gène d’intérêt : conditions de contrôle et expérimentales ;
- Une feuille de calcul Excel.
Et c’est tout ! Aucun logiciel coûteux n’est nécessaire.
Voici un résumé rapide des étapes clés de l’analyse Ct double delta (pour une explication détaillée, lisez cet article).
4 étapes de l’analyse Ct double delta
1. Prenez la moyenne des valeurs Ct pour le gène de maintien et le gène étant testé dans les conditions expérimentales et de contrôle, en retournant 4 valeurs. Ces 4 valeurs sont le gène testé expérimental (TE), le gène testé témoin (TC), le gène d’entretien expérimental (HE) et le gène d’entretien témoin (HC).
| Valeur moyenne du Ct expérimental | Valeur moyenne du Ct expérimental | Valeur moyenne du Ct de contrôle | Valeur moyenne du Ct de contrôle | Valeur \DeltaCt. (Expérimental) | Valeur du \DeltaCt (Contrôle) |
|---|---|---|---|---|---|
| TE | HE | TC | HC | \DeltaCTE | \DeltaCTC |
| 21.27 | 20,23 | 19,60 | 19,27 | 1,03 | 0,33 |
2. Calculez les différences entre les valeurs expérimentales (TE – HE) et les valeurs de contrôle (TC – HC). Ce sont vos valeurs de \DeltaCt pour les conditions expérimentales (\DeltaCTE) et de contrôle (\DeltaCTC), respectivement.
3. Ensuite, calculez la différence entre les valeurs de \DeltaCT pour les conditions expérimentales et de contrôle (\DeltaCTE – \DeltaCTC) pour arriver à la valeur de double delta Ct (ddCt).
4. Comme tous les calculs sont en logarithme base 2, chaque fois qu’il y a deux fois plus d’ADN, vos valeurs de Ct diminuent de 1 et ne seront pas divisées par deux. Vous devez calculer la valeur de 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} pour obtenir le fold change de l’expression.
| Valeur du Ct (expérimental) | Valeur du Ct (contrôle) | Valeur du Ctd | Expression Fold Change |
|---|---|---|---|
| dCTE | dCTC | ddCt | 2^-ddCt |
| 1.03 | 0,33 | 0,70 | 0,615572207 |
Que signifie cette valeur ?
Maintenant que vous avez votre valeur de changement de pli, que signifie-t-elle réellement ? Cette valeur est le changement de pli de votre gène d’intérêt dans la condition de test, par rapport à la condition de contrôle, qui a tous été normalisé à votre gène de maintien.
Pour rendre les choses un peu plus claires – vous pouvez y penser comme un pourcentage. Un fold change de 1 signifie qu’il y a 100% d’expression génique dans votre condition de test que dans votre condition de contrôle – il n’y a donc aucun changement entre le groupe expérimental et le groupe de contrôle. Une valeur de changement de plis supérieure à 1 indique une régulation positive du gène d’intérêt par rapport au contrôle (changement de 1,2 plis = expression du gène de 120 % par rapport au contrôle, 5 = 500 %, 10 = 1 000 %, etc.) Les valeurs inférieures à 1 indiquent une dérégulation du gène par rapport au contrôle (un changement de pli de 0,5 correspond à 50 % de l’expression du gène par rapport au contrôle, donc à la moitié de l’expression du contrôle, etc.).
Vous pouvez présenter ces données sous forme de diagrammes à barres de changement de pli, en représentant graphiquement les conditions de contrôle égales à 1. Vous pouvez également utiliser des analyses statistiques pour vérifier la signification des changements, par exemple en utilisant une analyse de la variance (ANOVA) ou des tests t, selon ce qui est approprié pour votre montage expérimental !
En suivant ces étapes, vous pouvez effectuer votre analyse qPCR où que vous soyez, même si vous êtes en voyage. Pour rendre les choses encore plus faciles, vous pouvez créer un modèle Excel à utiliser à chaque fois. Vous n’aurez alors qu’à saisir vos données et vous étonnerez les autres par votre alacrité à réaliser des analyses !
Parution originale le 9 juillet 2016. Révisé et mis à jour le 8 février 2021.
Lecture complémentaire
Livak KJ, Schmittgen TD. Analyse des données d’expression génétique relative à l’aide de la PCR quantitative en temps réel et de la 2^{-2\Delta\Delta C_{t}}. Method. Méthodes. 2001;25:402-8.
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