Gertrude est vue pour la première fois dans l’acte 1 scène 2 alors qu’elle tente de réconforter Hamlet sur la perte de son père, le suppliant de rester à la maison plutôt que de retourner à l’école à Wittenberg. Elle continue à s’inquiéter pour lui dans le deuxième acte, car elle se range du côté du roi Claudius et envoie Rosencrantz et Guildenstern pour remonter le moral de son fils. De plus, plutôt que d’attribuer la folie soudaine d’Hamlet au rejet d’Ophélie (comme le pense Polonius), elle croit que la cause est son père, la mort du roi Hamlet et son mariage rapide avec Claudius : « Je doute qu’il s’agisse d’une autre cause que la principale : la mort de son père et notre mariage précipité. » Au troisième acte, elle écoute avec impatience le rapport de Rosencrantz et Guildenstern sur leur tentative de le réconforter, et soutient le plan du roi et de Polonius d’observer Hamlet depuis un point d’observation caché pendant qu’il parle avec Ophélie, dans l’espoir que sa présence le guérira.
A l’acte suivant, Gertrude raconte à Claudius le meurtre de Polonius, convaincue qu’Hamlet est vraiment fou. Elle fait également preuve d’une compassion et d’une affection véritables en observant avec les autres Ophélie chanter et agir dans une folie absolue. Lors de l’enterrement d’Ophélie, elle exprime son ancien espoir que la jeune femme aurait pu épouser son fils : « J’espérais que tu aurais été la femme de mon Hamlet. » Lorsque Hamlet apparaît et se bat avec Laertes, elle lui demande de s’arrêter et que quelqu’un le retienne – disant qu’il est peut-être dans un accès de folie maintenant, mais que cela s’apaisera bientôt. Au début de la pièce, Gertrude ment plus à son mari qu’à son fils ; cependant, après la scène du placard, toute la situation est inversée.
Dans la scène finale, Gertrude remarque qu’Hamlet est fatigué pendant le combat avec Laertes, et propose de lui essuyer le front. Elle boit une coupe de poison destinée à Hamlet par le roi, contre la volonté de ce dernier, et meurt, criant d’agonie en tombant :
« Non, non, la boisson,-O mon cher Hamlet-La boisson, la boisson ! Je suis empoisonnée. »
L’opinion des autres personnages sur la reine est largement négative. Lorsque le fantôme de son ancien mari apparaît à Hamlet, il la décrit comme une « reine apparemment vertueuse », mais ordonne à Hamlet de ne pas la confronter à ce sujet et de laisser son jugement au ciel. Cependant, l’amour qu’il lui portait de son vivant était bienveillant, puisque Hamlet déclare que son père aurait retenu les éléments s’ils « visitaient trop rudement son visage ».
Hamlet la voit comme un exemple de la faiblesse des femmes (ce qui affecte sa relation avec Ophélie) et constamment blessé dans ses réflexions sur la rapidité (moins d’un mois) de son remariage.