Résultats
La visualisation de l’AMPc dans le cilium primaire de cellules vivantes à l’aide de biocapteurs fluorescents présente plusieurs défis uniques. Premièrement, les cils sont petits et minces, dépassant de 2 à 10 µm au-dessus de la surface de la cellule ; deuxièmement, bien que non mobiles, ils sont sujets à des mouvements dus à l’écoulement en vrac dans la solution de bain, et troisièmement, les signaux ciliaires de bonne foi peuvent être difficiles à séparer optiquement de la fluorescence de fond émanant du corps cellulaire. Bien que plusieurs rapporteurs d’AMPc ciblant les ciliums aient été décrits précédemment (19, 24, 25), nous avons cherché à générer des biocapteurs ratiométriques avec une luminosité et une fidélité de ciblage améliorées. Après avoir testé de nombreux modèles, nous avons constaté que les sondes de quatrième génération à base d’Epac du laboratoire de Kees Jalink (EpacH188 et une version à plus haute affinité, EpacH187) (26) combinées avec Arl13b, une protéine hautement localisée aux cils (27), offraient le meilleur ciblage, la meilleure luminosité et la meilleure sensibilité (Fig. 1A). Les capteurs incorporant le récepteur 5-HT6 ont donné une localisation comparable à celle des sondes couplées à Arl13b ; cependant, comme discuté ci-dessous, les récepteurs 5-HT6 non localisés aux cils ont provoqué une élévation de l’AMPc cellulaire en raison de l’activité constitutive bien connue de ce RCPG (28).
Signalisation AMPc dans les cils des cellules perméabilisées à la digitonine. Toutes les expériences ont été réalisées dans un tampon de type intracellulaire complété par de l’ATP et du GTP. (A) Les cellules mIMCD3 exprimant 5-HT6-mCherry et Arl13b-H187 localisés à la fois dans la cellule et le cilium n’ont pas répondu à 10 µM de 5-HT dans le corps cellulaire ou dans le cilium après un traitement de 2 min avec 20 μg/mL de digitonine (4 expériences, 5 cils). (B) De même, la réactivité à l’agoniste inverse, 1 µM SB742457, et la réponse de rebond subséquente à la 5-HT6 ont été perdues à la fois dans la cellule et le cilium après 2 min de traitement avec 20 μg/mL de digitonine (3 expériences, 3 cils). (C) La perméabilisation à la digitonine a supprimé le signal AMPc induit par 50 µM de forskoline dans les corps cellulaires, mais l’augmentation de l’AMPc était détectable dans les cils ; l’inhibition de la PDE induite par 1 mM d’IBMX n’a démasqué aucun signal (n = 4 expériences avec 4 cils/7 cellules). (D) La cotransfection d’AC3 n’a pas modifié la réponse à la forskoline. (E) Quantification et comparaison de la réponse de l’AMPc à la forskoline dans les corps cellulaires et dans les cils ; **P = 0,0002, ***P = 00019. Traces bleues = corps cellulaire, traces rouges = cils. Barres de temps : 3 min. L’axe des y est le rapport 480/535 nm.
Une explication évidente de l’absence d’effet dans les expériences précédentes était que l’AMPc ne s’accumulait pas suffisamment pour être capturé par le rapporteur. Cependant, lorsque la même expérience a été répétée en utilisant la forskoline pour activer directement les ACs (adénylyl cyclases) endogènes présents dans la membrane ciliaire, une accumulation faible mais cohérente d’AMPc a été détectée dans le microenvironnement du cilium mais pas dans le corps cellulaire (Fig. 4 C et E, bargraphes de gauche). Des résultats similaires ont été obtenus dans les cellules exprimant AC3 (36) (Fig. 4 D et E, histogrammes de droite), qui était localisé dans les cils lorsqu’il était exprimé dans les cellules mIMCD3 (Annexe SI, Fig. S8). En supposant que la perméabilisation n’a pas entraîné la perte de composants essentiels de la machinerie de signalisation du RCPG, le changement faible mais détectable après l’ajout de forskoline suggère qu’il aurait dû être possible de résoudre les signaux AMPc dépendants du RCPG s’ils avaient lieu dans le cilium. Ces données indiquent également que la membrane ciliaire des cellules mIMCD3 est restée intacte après le traitement à la digitonine.
Les données précédentes nous laissent avec la question de savoir pourquoi les RCPG ne sont pas compétents pour produire de l’AMPc une fois séquestrés dans le cilium. Des études antérieures ont cité l’entrée de Ca2+ à travers la membrane ciliaire comme un régulateur important de l’AMPc de l’organite en raison de la présence de canaux conducteurs de Ca2+ spécifiques aux cils (PKD2L1 et PKD2) et d’AC régulés par le Ca2+ (AC1, 8, 5 et 6) (11, 16, 23, 32, 37). Il a été signalé que les cils primaires des cellules mIMCD3 abritent des AC5 et/ou AC6 inhibables par le Ca2+ (10). Nous avons donc considéré que la perméabilité élevée au repos et au Ca2+ du cilium (38, 39) pouvait expliquer l’inactivation des ACs couplées au récepteur 5-HT6. Pour mieux répondre à ce point, nous avons amélioré le capteur en remplaçant la séquence de ciblage Arl13b par un récepteur 5-HT6 fonctionnel afin de cibler la fusion rapporteur AMP-GPCR directement sur le cilium (5-HT6-EpacH187). Conformément aux données des figures 3I et 4C, lorsqu’il est ciblé exclusivement sur le cilium, le 5-HT ne produit pas de signal AMPc mesurable (figure 5A). L’exposition des cellules à des solutions nominalement exemptes de Ca2+ n’a pas sauvé la réponse 5-HT dans les cils (Fig. 5B), ce qui indique que l’entrée de Ca2+ à travers la membrane ciliaire n’a pas supprimé le signal. Nous avons envisagé que l’expression de 5-HT6 pouvait modifier la distribution ciliaire de la protéine Gαs dans les cellules mIMCD3, mais les expériences d’immunomarquage ont suggéré que ce n’était pas le cas (Annexe SI, Fig. S9). Cependant, lorsque nous avons testé l’effet de la 5-HT dans des cellules prétraitées avec du SAG (250 nM à 1 µM) pour activer les récepteurs Smo (40), nous avons pu restaurer la sensibilité du récepteur 5-HT6 à l’agoniste (Fig. 5C). La sensibilité à l’agoniste inverse était également apparente, ce qui implique la restauration de l’activité constitutive (Fig. 5D).
L’activation de la voie Hedgehog augmente la réponse AMPc rapportée par 5-HT6-Epac-H187 à la 5-HT et à la dopamine dans les cils primaires : (A) Conformément aux données des figures 3I et 4C, les cellules mIMCD3 n’ont pas répondu à 10 µM de 5-HT lorsque la fusion capteur/récepteur était confinée strictement à la membrane ciliaire (6 expériences, 6 cils). (B) L’atténuation du niveau élevé de Ca2+ dans les cils en plaçant les cellules dans une solution nominalement exempte de Ca2+ n’a pas sauvé la signalisation AMPc stimulée par la 5-HT (5 expériences, 6 cils). (C) Après un prétraitement pendant la nuit avec 1 µM de SAG, 5 cils sur 6 (6 expériences) ont répondu à la stimulation par la 5-HT (**P = 0,000992). (D) Le prétraitement avec 1 µM de SAG a sauvé la réponse à 1 µM de SB742257 (-35,5 ± 11,2 % sous la ligne de base par rapport à l’augmentation subséquente de l’AMPc provoquée par 10 µM de 5-HT ; typique de 4 expériences, 4 cils). (E) Une augmentation de l’AMPc dans les cils du NIH 3T3 (typique de 9 expériences, 11 cils) a été provoquée par 10 μM de 5-HT. (F) Le prétraitement de nuit avec 1 μM de SAG a significativement augmenté la réponse au 5-HT (**P = 0,00034 ; 6 expériences, 7 cils). Le prétraitement de nuit avec 10 μM de cyclopamine (Cyclo) a eu un effet négligeable (8 expériences, 9 cils, graphique en barres). (G et H) La somatostatine (SST) 100 nM a atténué la réponse 5-HT dans les cils hébergeant SSTR3-GFP avec et sans prétraitement par SAG (G : 5 expériences, 6 cils ; H : 2 expériences, 5 cils). (I et J) Le prétraitement par SAG a augmenté la réponse à la dopamine (DA) 10 nM (I : 4 expériences, 4 cils, J : 4 expériences, 6 cils, **P = 0,002476). Traces bleues, corps cellulaire ; traces rouges, cils. Barres de temps : 3 min. L’axe des y est le rapport FRET 480/535 nm. Les graphiques à barres indiquent la réponse 5-HT ou DA en pourcentage de la réponse forskoline/IBMX ; les barres d’erreur représentent le SEM.
Les résultats précédents nous ont laissé la question de savoir si la régulation à la hausse inattendue, dépendante du SAG, du récepteur 5-HT6 exprimé dans les cellules mIMCD3 était spécifique du type de cellule et/ou du RCPG. Contrairement aux cellules mIMCD3, la stimulation des cellules 3T3 (Fig. 5E) et des MEF (Annexe SI, Fig. S10A) avec de la 5-HT a produit un changement de rapport mesurable qui était, cependant, significativement augmenté après le traitement par SAG (Fig. 5F et Annexe SI, Fig. S10B). Il est intéressant de noter que l’antagoniste des récepteurs lissés, la cyclopamine, dont on pourrait s’attendre à ce qu’il ait l’effet opposé à celui de la SAG, n’a pas aboli la signalisation AMPc stimulée par la 5-HT dans les cils primaires des cellules 3T3 (graphique à barres, figure 5F).
En utilisant ce système, nous avons également pu évaluer la capacité d’un RCPG couplé à la Gαi ciliaire, le SSTR3, à inverser les signaux AMPc stimulés par la sérotonine dans le cilium. Le traitement de cellules 3T3 coexprimant SSTR3-GFP et 5-HT6-H187 avec de la somatostatine a inversé les réponses 5-HT pour les ramener à la ligne de base en 2 min en présence et en l’absence de traitement par SAG (Fig. 5 G et H), ce qui indique un contrôle local de la fonction 5-HT6. Nous avons ensuite testé comment le SAG affectait l’activité d’un autre RCPG couplé aux Gαs ciliaires, le récepteur D1R de la dopamine (5). D1R-EGFP a été coexprimé avec 5-HT6-H187 dans des cellules 3T3, et les cellules présentant une fluorescence uniquement dans les cils ont été sélectionnées. Dix nanomolaires de dopamine ont produit des signaux d’AMPc petits mais mesurables dans les cellules témoins (Fig. 5I), et là encore, le signal a été significativement augmenté après le traitement par SAG (Fig. 5J ; résumé dans le graphique à barres).