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Résultats et discussion

La conjugaison de Spirogyra a été signalée comme étant induite par la diminution de la teneur en azote ou l’épuisement de celui-ci (Grote 1977 ; Yamashita et Sasaki 1979 ; Simons et al. 1984). Nous avons donc d’abord essayé d’induire la conjugaison en appauvrissant le milieu de culture en azote. Cependant, cette méthode s’est avérée infructueuse. Grote (1977) a signalé que la conjugaison était induite dans un milieu de closterium inorganique pur et que la valeur du pH était importante. Bien que nous ayons incubé les filaments d’algues dans le milieu de différents pH, la conjugaison n’a pas été induite. De plus, d’autres essais, diverses températures et l’appauvrissement en divers nutriments, ont été infructueux. Il a été rapporté que la conjugaison a été induite par l’incubation de filaments d’algues sous illumination continue chez certaines espèces de Spirogyra (Yamashita et Sasaki 1979). Cependant, nos matériaux n’ont pas montré de conjugaison, même lorsque les filaments ont été incubés sans source d’azote sous une illumination continue pendant 2 semaines. Après ces différents essais, nous avons finalement réussi à induire la conjugaison en incubant des filaments sur une plaque d’agar préparée à l’aide d’APW à 23°C sous un cycle L-D de 12:12 h pendant 4 jours. Des rhizoïdes en forme de tige se sont également formés à l’extrémité distale des cellules terminales pendant l’incubation. Lorsque les filaments sur la plaque de gélose ont été incubés dans l’obscurité, le phénomène de conjugaison n’a pas été induit. Allen (1958) a rapporté que la conjugaison était induite par l’incubation sur une plaque d’agar. Elle a maintenu une culture de stock en utilisant le milieu sol-eau de Pringsheim (Pringsheim 1946) sous un régime de 16 heures de lumière (tube fluorescent blanc froid)-8 heures d’obscurité à environ 20°C. Pour l’induction de l’accouplement, plusieurs filaments ont été transférés sur de la gélose Difco à 1,5% préparée avec de l’eau distillée et incubés à environ 20°C sous un cycle L-D de 16:8 heures. Après une incubation de quelques jours, des zygospores se sont formées sur la gélose. Bien que les conditions de lumière et de température pendant l’incubation aient été différentes, la méthode d’Allen (1958) était fondamentalement la même que la nôtre. Nous avons ensuite analysé les facteurs responsables de l’induction de la conjugaison sur la plaque de gélose, comme suit.

Nous nous sommes demandé si un ou des contaminants inconnus contenus dans la poudre de gélose étaient responsables de l’induction de la conjugaison. Nous avons examiné cette possibilité par l’expérience suivante. De la poudre d’agar (Wako, Osaka, Japon) a été mise en suspension dans de l’APW et maintenue à 4°C sous agitation pendant une nuit. Après centrifugation (185×g, 10 min), le culot résultant a été lavé 2 fois avec de l’APW par centrifugation. Le culot final de gélose a été suspendu dans de l’APW frais et les plaques ont été préparées. La conjugaison a été induite avec succès sur cette gélose. Lorsque les filaments d’algues ont été incubés dans le surnageant obtenu par le lavage de la poudre de gélose, la conjugaison n’a pas été induite du tout (données non présentées). Ainsi, l’incubation sur la plaque de gélose mais pas le contaminant soluble était responsable de l’induction de la conjugaison.

Puisque l’APW ne contenait pas de produits chimiques azotés, la plaque de gélose ne devrait pas ou très peu contenir d’azote. Par conséquent, il était possible que les deux facteurs, l’emplacement sur la plaque de gélose et l’appauvrissement en azote, agissent en synergie dans l’induction. Pour examiner cette possibilité, nous avons incubé des filaments sur une plaque de gélose préparée avec de l’APW complété avec 1 mM KNO3. Sur cette gélose, la conjugaison a également été induite (Fig. 1a), ce qui indique que l’appauvrissement en azote n’est pas responsable de l’induction de la conjugaison. De plus, la conjugaison a été induite lorsque les filaments ont été incubés sur une plaque de gélose préparée à l’aide du milieu closterium, qui contient divers nutriments (Fig. 1b). Ces résultats ont indiqué sans équivoque que la localisation sur la plaque de gélose en soi est un facteur responsable de l’induction de la conjugaison.

L’induction de la conjugaison sur une plaque de gélose a été examinée chez une autre espèce, S.fuluviatilis, qui a différencié des rhizoïdes en coupant les filaments d’algues (données non montrées) comme dans le cas de S. castanacea. Chez cette espèce, la conjugaison a également été induite lors de l’incubation sur une plaque de gélose préparée avec de l’APW. Nous avons également examiné la conjugaison sur une plaque de gélose chez trois Spirogyra, qui ne différencient pas les rhizoïdes. S.ellipsospora Transeau a été maintenu au laboratoire comme contaminant de la culture de Chara. Les deux autres Spirogyra sp. collectées dans le lac Biwa ont été maintenues en culture axénique pendant 6 mois. Ces trois Spirogyra n’ont pas montré de conjugaison par incubation sur plaque d’agar.

Dans certaines espèces de Spirogyra, la conjugaison a été induite par la baisse ou l’appauvrissement de la teneur en azote (Grote 1977 ; Yamashita et Sasaki 1979 ; Simons et al. 1984). En plus de la teneur en azote, l’intensité lumineuse et/ou le pH ont dû être contrôlés chez S. majuscule (Grote 1977). Chez S. castanacea et S.fuluviatilis, l’incubation sur la plaque d’agar était efficace et l’épuisement de l’azote n’était pas nécessaire (présente étude). D’autre part, Agrawal et Singh (2002) ont rapporté que Spirogyra sp. n’a pas commencé la conjugaison sur une plaque d’agar 2-10%. Ceci est similaire à nos résultats obtenus chez Spirogyra sp. qui n’a pas différencié les rhizoïdes. Ainsi, les facteurs nécessaires à l’induction de la conjugaison sont très variables entre les espèces de Spirogyra. Nous nous sommes demandé si l’inhibition de la croissance était responsable de l’induction de la conjugaison sur une plaque de gélose. Pendant l’incubation sur la gélose préparée avec le milieu APW ou le milieu closterium, les cellules ont proliféré par division cellulaire sur les deux géloses, mais les cellules n’ont pas commencé à former la papille du tube de conjugaison. Ainsi, l’inhibition de la croissance n’était pas un déclencheur de la conjugaison.

Pour examiner la présence du type d’accouplement entre les filaments, la culture monoclonale de S. castanacea a été soumise à l’induction de la conjugaison. Après 48 h d’incubation, deux types de conjugaison ont été trouvés dans le même filament (figure 2a-c). La figure 2b montre la conjugaison scalariforme induite par les cellules (pointe de flèche dans la figure 2a). D’autre part, la figure 2c montre la conjugaison latérale induite par les cellules (flèche sur la figure 2a). Les zygospores se sont formées normalement après la conjugaison latérale (Fig. 2d). Yamagishi (1977) a signalé que la conjugaison scalariforme est généralement observée, tandis que la conjugaison latérale était rarement observée chez S.castanacea. Notre résultat était cohérent avec celui de Yamagishi (1977). Cependant, dans la limite de nos connaissances, l’induction des deux conjugaisons scalariforme et latérale dans un même filament (Fig. 2a) est le premier rapport. Lorsque deux filaments se sont appariés, toutes les cellules d’un filament se sont comportées comme des mâles et celles de l’autre filament comme des femelles dans la plupart des cas. Très rarement, cependant, des zygospores ont été formées dans les deux filaments (Fig. 3). Ainsi, le type d’accouplement n’est pas fixé, du moins chez S.castanacea. L’hypnozygote a été formé par incubation sur la plaque d’agar pendant environ 1 mois. Cependant, il a été difficile d’induire la germination de manière reproductible en ajoutant du milieu closterium. Une méthode pour induire la germination de manière reproductible doit être trouvée.

Nous avons examiné l’identification des matériaux extracellulaires sécrétés pendant le processus d’accouplement en utilisant diverses lectines chez S. castanacea. Parmi les 19 lectines examinées (BSL-I, BSL-II, Con A, DBA, DSL, ECL, jacaline, LEL, PHA-E, PHA-L, PNA, PSA, RCA I, SBA, SJA, STL, UEA I, VVL et WGA), BSL-1, Con A, jacaline, RCA-I et SBA ont coloré les cellules reproductrices mais pas les cellules végétatives (Tableau 1). Yoon et al. (2009) ont signalé que trois lectines, Con A, RCA et UEA, présentaient un marquage considérable sur les matières extracellulaires de S. varians (Hassall) Kützing. Ainsi, les matériaux de liaison aux lectines sécrétés pendant la conjugaison semblent différer dans une certaine mesure entre les espèces. Nous avons déjà signalé que le BSL-I et la jacaline présentaient des profils de coloration contrastés dans le rhizoïde : la jacaline colore clairement le contour du rhizoïde, tandis que la coloration du BSL-I est diffuse (Inoue et al. 1999, Ikegaya et al. 2008b). Il a été suggéré que le matériau se liant au BSL-I était responsable de l’adhésion des filaments au substrat. D’autre part, le matériel de liaison à la jacaline a été supposé être impliqué dans la reconnaissance du substrat (Ikegaya et al. 2008b). Dans la présente étude, nous avons donc concentré notre attention sur le BSL-I et la jacaline (Fig. 4). Après 48 heures d’incubation sur une plaque de gélose, un filament représenté sur la Fig. 4a a formé des papilles dans diverses directions. Nous avons supposé que ce filament a commencé à former des papilles en l’absence du filament partenaire. Le BSL-I a fortement coloré la surface des papilles. Les septa entre les cellules étaient également fortement colorés. Ensuite, nous avons coloré une paire de filaments ayant commencé leur conjugaison après 48 heures d’incubation. Dans la Fig. 4b, il a été jugé que le filament supérieur était un gamète mâle et que le filament inférieur était un gamète femelle, respectivement, puisque le diamètre des cellules inférieures du filament devient plus grand que celui du filament supérieur. Les tubes de conjugaison allongés à partir des cellules appariées étaient fortement colorés, tandis que la surface cellulaire entière du gamète femelle était faiblement colorée (Fig. 4b′). Après 72 h d’incubation, la surface cellulaire entière du gamète mâle était également faiblement colorée (Fig. 4c′). Après 96 h d’incubation sur une plaque de gélose, des zygospores se sont formées (Fig. 4d). Les tubes de conjugaison étaient fortement colorés (Fig. 4d′), tandis que la surface des zygospores n’était pas colorée. Ensuite, la coloration à la jacaline a été examinée. Les cellules des filaments de la Fig. 3e ont formé des papilles dans la même direction. Nous avons supposé que ce filament a commencé la conjugaison en présence d’un filament partenaire et qu’il a été perdu lors du transfert sur la lame de verre. Les papilles étaient fortement colorées par la jacaline (Fig. 4e′). Tout au long du processus de conjugaison, la jacaline a principalement coloré les canaux de conjugaison (Fig. 4f′-h′). Le schéma de coloration avec Con A, RCA-I et SBA a également été examiné (données non présentées). Le Con A a fortement coloré les septa entre les zygospores formées dans le gamète femelle, tandis que les papilles l’étaient très faiblement. Lorsque les zygospores étaient formées, le schéma de coloration avec le RCA-I ou le SBA était similaire à celui du BSL-I, comme le montre la figure 4d′.

Nous examinons l’effet de six lectines, BSL-I, Con A, jacaline, RCA-I, SBA, et WGA, sur la conjugaison. Les filaments ont été pré-incubés dans de l’APW supplémenté avec l’une ou l’autre des lectines pendant 1 jour. Ensuite, ils ont été transférés sur une plaque de gélose supplémentée avec la même lectine et incubés pendant 4 jours. On a constaté que la jacaline inhibait sévèrement la formation de zygospores, mais pas les autres (données non présentées). L’analyse systématique a montré que la jacaline inhibait sévèrement l’étape du tout début ; début de la formation de la papille (Fig. 5). Ensuite, la réversibilité de l’inhibition par la jacaline a été examinée. Les filaments ont été successivement incubés dans de l’APW supplémenté en jacaline pendant 1 jour, puis dans de l’APW dépourvu de jacaline pendant 1 jour. Ils ont ensuite été incubés sur une plaque de gélose sans jacaline pendant 4 jours. Cependant, la papille ne s’est pas formée du tout. Cette inhibition irréversible pourrait être causée par la forte liaison de la jacaline. Yoon et al. (2009) ont signalé que le RCA et l’UEA inhibaient la conjugaison. Cependant, ils n’ont pas identifié l’étape de l’inhibition. Bien que le BSL-I, le RCA-I, le Con A et le SBA aient également coloré le tube de conjugaison, ils n’en ont pas inhibé la formation. Les rôles des matériaux reconnus par le BSL-I, le RCA-I ou le SBA sont la cible de futures études.

Randhawa (1959) a suggéré une similarité entre les processus de conjugaison et la formation des rhizoïdes : un stimulus de contact est impliqué. D’autre part, Kniep (1928) pensait que les processus de conjugaison étaient essentiellement dus à un stimulus chimique (cité par Randhawa (1959)). Le tube de conjugaison et le rhizoïde commencent tous deux par la formation de la papille et peuvent s’allonger par la croissance de la pointe. Cependant, le tube de conjugaison se forme au niveau du flanc mais la rhizoïde se forme à l’extrémité distale de la cellule (Nagata 1973). La Jacaline a clairement coloré le contour du tube de conjugaison (Fig. 3e′-h′) et du rhizoïde (Ikegaya et al. 2008b). La Jacaline n’a pas inhibé la formation de la rhizoïde mais a inhibé la différenciation en rhizoïde en forme de rosette (Ikegaya et al. 2008b). Dans le cas des tubes de conjugaison, cependant, la jacaline a inhibé la formation de la papille en soi (Fig. 5). Il semble que le rôle du matériau de liaison de la jacaline soit différent dans le tube de conjugaison et le rhizoïde.

Le succès de l’induction reproductible de la conjugaison en laboratoire a ouvert une voie pour des analyses systématiques de la conjugaison chez Spirogyra, comme le mécanisme de détermination de la sexualité des cellules, le rôle des matériaux de liaison des lectines, le mécanisme de mouvement du protoplaste mâle.