La grande majorité des procédures IHC/ICC emploient la fixation des tissus et des cellules en utilisant des fixateurs à base de formaldéhyde. Le protocole ci-dessous décrit la technique permettant de générer une solution de formaldéhyde à 4 % dans du PBS. Le fixateur le plus efficace doit être déterminé expérimentalement.
Avertissement : Le formaldéhyde est toxique. Veuillez lire la fiche signalétique avant de travailler avec ce produit chimique. Il faut porter des gants et des lunettes de sécurité et faire les solutions à l’intérieur d’une hotte.
Veuillez lire le protocole dans son intégralité avant de commencer.
Réactifs requis
- H2O désionisé
- HCl (dilué)
- NaOH (1 N)
- Paraformaldéhyde en poudre
- 1X PBS : 0,145 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0081 M Na2HPO4, 0,0015 M KH2PO4, pH 7.4
Matériels
- Unités de filtration
- Verrerie et barreau d’agitation (dédié à la solution de formaldéhyde)
- Gants et protection oculaire
- Plaque chaude avec agitateur magnétique
- Thermomètre
- Hotte ventilée
.
Procédure
- Pour 1 L de formaldéhyde à 4%, ajouter 800 mL de PBS 1X dans un bécher en verre sur une plaque d’agitation dans une hotte ventilée. Chauffer en agitant jusqu’à environ 60 °C. Veillez à ce que la solution ne bouille pas.
- Ajouter 40 g de poudre de paraformaldéhyde à la solution de PBS chauffée.
- La poudre ne se dissoudra pas immédiatement dans la solution. Augmenter lentement le pH en ajoutant goutte à goutte du NaOH 1 N à l’aide d’une pipette jusqu’à ce que la solution se clarifie.
- Une fois que le paraformaldéhyde est dissous, la solution doit être refroidie et filtrée.
- Ajuster le volume de la solution à 1 L avec du PBS 1X.
- Revoir le pH, et l’ajuster avec de petites quantités de HCl dilué à environ 6.9.
- La solution peut être aliquotée et congelée ou stockée à 2-8 °C jusqu’à un mois.
La différence entre le paraformaldéhyde, le formaldéhyde et le formol
Le paraformaldéhyde (le nom chimique est polyoxyméthylène) est une poudre de formaldéhyde polymérisé qui, à elle seule, ne peut pas fixer les tissus. Pour être utilisable comme fixateur de tissus, le paraformaldéhyde doit être dissous dans de l’eau chaude pour devenir une solution de formaldéhyde. La formaline est une solution saturée de formaldéhyde dans l’eau (37% en poids, 40% en volume) contenant 10-15% de méthanol. Le méthanol est ajouté pour ralentir la polymérisation en formaldéhyde, ce qui réduit le pouvoir de fixation du formol. Le formol peut également être fabriqué sous une forme sans alcool à partir de paraformaldéhyde en poudre.