A repülőtéren vagy, és a professzorodnak holnap reggelre beadandó jelentéssel töltöd az időt. Megvannak az adataid. Miért nem használja ki az időt, és számolja ki az expressziós hajtásváltozást azoknál a géneknél, amelyeket a múlt héten végzett első qPCR-kísérletében tesztelt?

Ez egyszerű – megmutatom, hogyan.

Check Your Method

A qPCR-adatok elemzésének két fő módja van: a kettős delta Ct-elemzés és a relatív standard görbe módszer (Pfaffl-módszer). Mindkét módszer feltételezésekkel és korlátozásokkal jár, ezért az elemzéshez használt módszer a kísérleti tervtől függ.

A kettős delta Ct elemzés feltételezi, hogy:

  • a primer készletek között azonos primerhatékonyság van (pl. 5%-on belül);
  • a referencia- és a célgének amplifikációs hatékonysága közel 100%-os;
  • a belső kontrollgének folyamatosan expresszálódnak, és a kezelés nem befolyásolja őket.

A módszer általában olyan kísérleteket szolgál ki, amelyek nagyszámú DNS-mintát és kevés vizsgálandó gént tartalmaznak.

A relatív standardgörbe módszer feltételezi, hogy:

  • a kontroll és a kezelt minták között azonos hatékonyság van.

Ez a módszer jobban működik, ha kevesebb DNS-mintával, de nagyobb számú vizsgálandó génnel rendelkezik.

Mire van szüksége a dupla delta Ct elemzéshez

  • qPCR Ct értékek (nyers adatok):
    • a házőrző gén: kontroll és kísérleti körülmények;
    • a vizsgált gén: kontroll és kísérleti körülmények;
  • egy Excel táblázat.

És ennyi! Nincs szükség drága szoftverre.

Itt van egy gyors összefoglaló a kettős delta Ct elemzés legfontosabb lépéseiről (a részletes magyarázatért olvassa el ezt a cikket).

4 lépés a kettős delta Ct elemzéshez

1. Vegyük ki a házőrző gén és a vizsgált gén Ct-értékeinek átlagát a kísérleti és a kontroll körülmények között, ami 4 értéket ad vissza. A 4 érték a következő: Kísérleti tesztelt gén (TE), kontroll tesztelt gén (TC), kísérleti házőrző gén (HE) és kontroll házőrző gén (HC).

Átlagos kísérleti Ct-érték Átlagos kísérleti Ct-érték Átlagos kontroll Ct-érték Átlagos kontroll Ct-érték \DeltaCt Érték (Kísérleti) \DeltaCt érték (Kontroll)
TE HE TC HC \DeltaCTE \DeltaCTC
21.27 20.23 19.60 19.27 1.03 0.33

2. Számítsuk ki a kísérleti értékek (TE – HE) és a kontrollértékek (TC – HC) különbségét. Ezek a kísérleti (\DeltaCTE) és a kontroll (\DeltaCTC) körülményekre vonatkozó \DeltaCt értékek.

3. Ezután számítsa ki a kísérleti és a kontroll körülményekre vonatkozó \DeltaCt értékek különbségét (\DeltaCTE – \DeltaCTC), hogy megkapja a dupla delta Ct értéket (ddCt).

4. Mivel minden számítás a logaritmus 2-es bázisában történik, minden alkalommal, amikor kétszer annyi DNS van, a Ct-értékek 1-gyel csökkennek, és nem feleződnek. Ki kell számítania a 2^{-2\\Delta\Delta C_{t}} értékét, hogy megkapja a fold change kifejezést.

.

dCt érték (kísérleti) dCt érték (kontroll) ddCt érték Expression Fold Change
dCTE dCTC ddCt 2^-ddCt
1.03 0.33 0.70 0.615572207

Mit jelent az érték?

Most, hogy megvan a fold change értéke, mit is jelent valójában? Ez az érték az Önt érdeklő gén hajtásváltozása a vizsgálati feltételben, a kontroll feltételhez viszonyítva, ami mind normalizálva lett a házőrző génre.

Hogy egy kicsit érthetőbb legyen – gondolhat rá úgy is, mint egy százalékos értékre. Az 1 szeres változás azt jelenti, hogy 100%-ban ugyanannyi génexpresszió van a tesztfeltételben, mint a kontrollfeltételben – tehát nincs változás a kísérleti csoport és a kontrollcsoport között. Az 1 feletti fold-change érték a kontrollhoz képest az adott gén upregulációját mutatja (1,2-szeres változás = 120%-os génexpresszió a kontrollhoz képest, 5 = 500%, 10 = 1000% stb.). Az 1 alatti értékek a kontrollhoz viszonyított gén leregulációját jelzik (a 0,5-szeres változás 50%-os génexpressziót jelent a kontrollhoz viszonyítva, tehát fele akkora expressziót, mint a kontrollban, stb.).

Az adatokat fold-change oszlopdiagramok formájában is bemutathatja, a kontrollkörülményeket 1-gyel egyenlően ábrázolva. Statisztikai elemzésekkel is ellenőrizheti a változások szignifikanciáját, pl. varianciaanalízis (ANOVA) vagy t-tesztek segítségével, bármi is feleljen meg az Ön kísérleti elrendezésének!

Ezekkel a lépésekkel bárhol elvégezheti a qPCR-elemzést, még akkor is, ha éppen úton van. Hogy még egyszerűbbé tegye a dolgokat, létrehozhat egy Excel-sablont, amelyet minden alkalommal használhat. Ezután már csak be kell adnia az adatait, és meg fog lepni másokat az elemzések elvégzésében tanúsított gyorsaságával!

Eredetileg 2016. július 9-én jelent meg. Felülvizsgálták és frissítették 2021. február 8-án.

További olvasmányok

Livak KJ, Schmittgen TD. Relatív génexpressziós adatok elemzése RealTime Quantitative PCR és a 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} segítségével. Method. Methods. 2001;25:402-8.

Segített ez önnek? Akkor kérjük, ossza meg a hálózatával.

Suganth Kannan

írta.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.