Eredmények
A cAMP képalkotása az élő sejtek primer csillókban fluoreszcens bioszenzorok segítségével számos egyedi kihívást jelent. Először is, a csillók kicsik és karcsúak, 2-10 µm-re állnak ki a sejt felszíne fölé; másodszor, bár nem mozognak, a fürdőoldatban lévő tömegáramlás miatt mozgásnak vannak kitéve, és harmadszor, a jóhiszemű csillójeleket nehéz lehet optikailag elkülöníteni a sejttestből származó háttérfluoreszcenciától. Bár korábban már számos cilium-célzott cAMP-reportert leírtak (19, 24, 25), mi arra törekedtünk, hogy jobb fényerősségű és célzáshűségű ratiometrikus bioszenzorokat hozzunk létre. Számos tervezet tesztelése után úgy találtuk, hogy a legjobb célzást, fényerőt és érzékenységet a Kees Jalink laboratóriumából származó negyedik generációs Epac-alapú szondák (EpacH188 és egy magasabb affinitású változat, az EpacH187) (26) nyújtják, kombinálva az Arl13b-vel, egy nagymértékben a csillókra lokalizált fehérjével (27) (1A. ábra). Az 5-HT6 receptort tartalmazó szenzorok hasonlóan jó lokalizációt adtak, mint az Arl13b-hez kapcsolt szondák; azonban, amint azt alább tárgyaljuk, a nem a csillókra lokalizált 5-HT6 receptorok e GPCR jól ismert konstitutív aktivitása miatt a celluláris cAMP emelkedését okozták (28).
cAMP jelátvitel a digitonin-permeabilizált sejtek csillóiban. Minden kísérletet ATP-vel és GTP-vel kiegészített intracelluláris-szerű pufferben végeztünk. (A) Az 5-HT6-mCherry-t és Arl13b-H187-et expresszáló mIMCD3 sejtek mind a sejtben, mind a ciliumban lokalizálva nem reagáltak 10 µM 5-HT-re sem a sejttestben, sem a ciliumban 20 μg/mL digitoninnal történő 2 perces kezelés után (4 kísérlet, 5 cilia). (B) Hasonlóképpen, az inverz agonistára, az 1 µM SB742457-re való érzékenység és az azt követő 5-HT6 rebound válasz elveszett mind a sejtben, mind a ciliumban 20 μg/mL digitoninnal történő 2 perces kezelés után (3 kísérlet, 3 cilia). (C) A digitonin permeabilizáció ablilálta az 50 µM forskolin indukálta cAMP jelet a sejttestekben, de a cAMP növekedés kimutatható volt a csillókban; 1 mM IBMX indukálta PDE gátlás nem mutatta ki a jelet (n = 4 kísérlet, 4 csilló/7 sejt). (D) Az AC3 kotranszfekció nem változtatta meg a forskolin-választ. (E) A forskolinra adott cAMP-válasz mennyiségi meghatározása és összehasonlítása a sejttestekben és a csillókban; **P = 0,0002, ***P = 00019. Kék nyomok = sejttest, piros nyomok = csillók. Idősávok: 3 perc. Az y tengely a 480/535 nm arány.
Az előző kísérletekben tapasztalt hatás hiányának nyilvánvaló magyarázata az volt, hogy a cAMP nem halmozódott fel eléggé ahhoz, hogy a riporter rögzítse. Amikor azonban ugyanezt a kísérletet megismételtük forskolinnal, hogy közvetlenül aktiváljuk a ciliummembránban jelen lévő endogén AC-ket (adenilil-ciklázokat), a cAMP kismértékű, de következetes felhalmozódását észleltük a cilium mikrokörnyezetében, de nem a sejttestben (4. ábra C és E, bal oldali oszlopdiagramok). Hasonló eredményeket kaptunk az AC3-at (36) expresszáló sejtekben is (4. ábra D és E, jobb oldali oszlopdiagramok), amely a mIMCD3 sejtekben expresszálva a csillókra lokalizálódott (SI függelék, S8 ábra). Feltételezve, hogy a permeabilizáció nem vezetett a GPCR jelátviteli gépezet lényeges komponenseinek elvesztéséhez, a forskolin hozzáadását követő kis, de kimutatható változás arra utal, hogy a GPCR-függő cAMP jeleket fel kellett volna oldani, ha azok a ciliumban történnének. Ezek az adatok azt is jelzik, hogy a mIMCD3 sejtek ciliummembránja érintetlen maradt a digitonin kezelést követően.
Az előző adatok alapján felmerül a kérdés, hogy a GPCR-ek miért nem képesek cAMP előállítására, ha egyszer a ciliumban szekvenálódtak. Korábbi tanulmányok a cilia membránon keresztüli Ca2+ bejutást a cilia-specifikus Ca2+-vezető csatornák (PKD2L1 és PKD2) és a Ca2+-szabályozott AC-k (AC1, 8, 5 és 6) jelenlétének köszönhetően a szervezeti cAMP fontos szabályozójaként említik (11, 16, 23, 32, 37). A mIMCD3 sejtek primer csillókról azt jelentették, hogy Ca2+-gátló AC5 és/vagy AC6 csatornákat tartalmaznak (10). Ezért úgy gondoltuk, hogy a cilium magas nyugalmi és Ca2+ áteresztőképessége (38, 39) magyarázhatja az 5-HT6 receptorhoz kapcsolt AC-k inaktiválását. Ennek a kérdésnek a jobb kezelése érdekében továbbfejlesztettük a szenzort azáltal, hogy az Arl13b célszekvenciát egy funkcionális 5-HT6 receptorra cseréltük, hogy a cAMP riporter-GPCR fúziót közvetlenül a ciliumra irányítsuk (5-HT6-EpacH187). A 3I. és 4C. ábra adataival összhangban, amikor az 5-HT kizárólag a ciliumra irányult, az 5-HT nem adott mérhető cAMP-jelet (5A. ábra). A sejtek nominálisan Ca2+ -mentes oldatoknak való kitétele nem mentette meg az 5-HT-választ a csillókban (5B. ábra), ami azt jelzi, hogy a Ca2+ bejutása a csillómembránon keresztül nem nyomta el a jelet. Úgy gondoltuk, hogy talán az 5-HT6 expressziója megváltoztatta a Gαs fehérje ciliáris eloszlását a mIMCD3 sejtekben, de az immunfestési kísérletek szerint nem ez a helyzet (SI függelék, S9. ábra). Amikor azonban a Smo receptorok aktiválása érdekében SAG-gal (250 nM és 1 µM között) előkezelt sejtekben vizsgáltuk az 5-HT hatását (40), az 5-HT6 receptor agonistára való érzékenységét vissza tudtuk állítani (5C ábra). Az inverz agonistára való érzékenység is nyilvánvaló volt, ami a konstitutív aktivitás helyreállítására utal (5D ábra).
A hedgehog-útvonal aktiválása növeli az 5-HT6-Epac-H187 által jelentett cAMP-választ 5-HT-re és dopaminra primer csillókban: (A) A 3I. és 4C. ábrák adataival összhangban a mIMCD3 sejtek nem reagáltak 10 µM 5-HT-re, amikor a szenzor/receptor fúzió szigorúan a csillóhártya membránjára korlátozódott (6 kísérlet, 6 csilló). (B) A csillókban lévő magas szint csillapítása a sejtek nominálisan Ca2+ -mentes oldatba helyezésével nem mentette meg az 5-HT által stimulált cAMP jelátvitelt (5 kísérlet, 6 csilló). (C) 1 µM SAG-gal történő éjszakai előkezelést követően 6 cilia közül 5 (6 kísérlet) reagált az 5-HT stimulációra (**P = 0,000992). (D) Az 1 µM SAG-gal történő előkezelés megmentette az 1 µM SB742257-re adott választ (-35,5 ± 11,2% a kiindulási érték alatt a 10 µM 5-HT által kiváltott későbbi cAMP-növekedéshez képest; 4 kísérlet, 4 cilia jellemzője). (E) A cAMP növekedését az NIH 3T3 csillókban (9 kísérletre jellemző, 11 csilló) 10 μM 5-HT okozta. (F) Az 1 μM SAG-gal történő éjszakai előkezelés szignifikánsan növelte az 5-HT-választ (**P = 0,00034; 6 kísérlet, 7 csilló). A 10 μM ciklopaminnal (Cyclo) történő éjszakai előkezelés elhanyagolható hatással volt (8 kísérlet, 9 csilló, oszlopdiagram). (G és H) A 100 nM szomatosztatin (SST) mérsékelte az SSTR3-GFP-t hordozó csillók 5-HT-válaszát SAG előkezeléssel és anélkül (G: 5 kísérlet, 6 csilló; H: 2 kísérlet, 5 csilló). (I és J) A SAG előkezelés növelte a 10 nM dopamin (DA) választ (I: 4 kísérlet, 4 cilia, J: 4 kísérlet, 6 cilia, **P = 0,002476). Kék nyomok, sejttest; piros nyomok, csillók. Idősávok: 3 perc. Az y tengely a 480/535 nm-es FRET-arányt mutatja. A sávdiagramok az 5-HT- vagy DA-választ jelzik a forskolin/IBMX-válasz százalékában; a hibasávok SEM-et jelentenek.
Az előző eredmények után felmerült bennünk a kérdés, hogy a mIMCD3 sejtekben expresszálódó 5-HT6 receptor váratlan SAG-függő felszabályozása sejttípus- és/vagy GPCR-specifikus-e? A mIMCD3-tól eltérően a 3T3 sejtek (5E ábra) és a MEF sejtek (SI függelék, S10A ábra) 5-HT-val történő stimulálása mérhető arányváltozást eredményezett, amely azonban a SAG kezelést követően jelentősen fokozódott (5F ábra és SI függelék, S10B ábra). Érdekes módon a sima receptor antagonista ciklopamin, amelytől a SAG ellenkező hatását várhatnánk, nem szüntette meg az 5-HT által stimulált cAMP jelátvitelt a 3T3 sejtek primer csillókban (oszlopdiagram, 5F ábra).
Ezt a rendszert használva azt is meg tudtuk vizsgálni, hogy a csillók Gαi-csatolt GPCR-je, az SSTR3 képes-e visszafordítani a szerotonin által stimulált cAMP jeleket a csillókban. Az SSTR3-GFP-t és 5-HT6-H187-et koexprimáló 3T3 sejtek szomatosztatinnal történő kezelése 2 percen belül visszafordította az 5-HT-válaszokat a kiindulási szintre SAG-kezelés jelenlétében és hiányában (5. ábra G és H), ami az 5-HT6 funkció helyi szabályozására utal. Ezután tovább vizsgáltuk, hogy a SAG hogyan befolyásolja egy másik ciliáris Gαs-csatolt GPCR, a dopamin D1R receptor aktivitását (5). A D1R-EGFP-t az 5-HT6-H187-gyel együtt expresszáltuk 3T3 sejtekben, és a csak a csillókban fluoreszkáló sejteket szelektáltuk. Tíz nanomoláris dopamin kis, de mérhető cAMP-jelet eredményezett a kontrollsejtekben (5I. ábra), és a jel ismét jelentősen fokozódott a SAG-kezelés után (5J. ábra; a sávdiagramban összefoglalva).