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あなたは空港で、教授への報告書を明日の朝までに提出するために時間を浪費しています。 あなたは自分のデータを持っています。 その時間を利用して、先週行った最初の qPCR 実験でテストした遺伝子の発現倍率変化を計算してみませんか。

それは簡単です。

ダブルデルタCt解析は、以下を仮定しています：

• プライマーセット間のプライマー効率が等しい（すなわち、プライマーセット間のプライマー効率が等しい）。
• 内部コントロール遺伝子は常に発現しており、処理の影響を受けない。

この方法は一般的に、多数のDNAサンプルと検査する遺伝子数が少ない実験に適している。

• コントロールと処理サンプルの効率が等しいと仮定します。

この方法は、DNAサンプル数は少ないが、テストする遺伝子数が多い場合に有効です。

ダブルデルタCt解析に必要なもの

• qPCR Ct値（生データ）：
  • ハウスキーピング遺伝子：コントロールと実験条件、
  • 目的の遺伝子：コントロールと実験条件、
• エクセルシート

  そしてそれだけ! 高価なソフトウェアは必要ありません。

  ここで、二重デルタCt分析の主要なステップを簡単にまとめます（詳細な説明は、この論文をお読みください）。 実験条件と対照条件におけるハウスキーピング遺伝子と検査対象遺伝子のCt値の平均をとり、4つの値を返す。 4つの値とは、Gene being Tested Experimental (TE), Gene being Tested Control (TC), Housekeeping Gene Experimental (HE), Housekeeping Gene Control (HC)である。

  （実験） （コントロール）

  （実験）

  （実験） （テスト）HE

  実験平均Ct値	実験平均Ct値	コントロール平均Ct値	DeltaCt Value (実験）	\DeltaCt Value （コントロール）
  TE
  TC	HC	\DeltaCTE	\DeltaCTC
  21.27	20.23	19.60	19.27	1.03	0.33

  2 実験値（TE – HE）と対照値（TC – HC）の差を算出する。 実験値(TE – HE)と対照値(TC – HC)の差を計算し、実験条件( \DeltaCTE)と対照条件( \DeltaCTC)の \DeltaCt 値とします。 そして実験条件と対照条件の \DeltaCT 値の差( \DeltaCTE – \DeltaCTC )を計算し、ダブルデルタCt値(ddCt )とします。

  4.計算は全て対数2進法なので、DNAが2倍になるたびにCt値は1ずつ減っていき、半分にはなりません。 2^{-2DeltaDelta C_{t}}の値を計算しないと、式のfold changeは得られません。

  dCt Value (Experimental)	dCt Value (Control)	ddCt Value	発現Fold Change
  dCTE	dCTC	ddCt	2^-.ddCt
  1.03	0.33	0.70	0.615572207

  値の意味は？

  fold changeの値はわかったが、実際にはどうなのか？ この値は、対照条件に対する試験条件での関心のある遺伝子の倍数変化であり、ハウスキーピング遺伝子に正規化されています。 倍率が1であれば、テスト条件とコントロール条件の遺伝子発現が100%同じであることを意味し、実験グループとコントロールグループの間に変化がないことを意味します。 fold-changeの値が1以上であれば、対象遺伝子の発現量がコントロールに対して相対的に増加していることを示す（1.2倍の変化＝コントロールに対して120％の遺伝子発現、5＝500％、10＝1,000％、など）。 1以下の値はコントロールに対する遺伝子のダウンレギュレーションを示している（fold change of 0.5 is 50% gene expression relative to control, so half as much expression as in the control, etc）。

  これらのデータをfold-change bar chartとして、コントロール条件を1としたグラフを表示することが可能である。 また、統計解析を使用して、例えば分散分析 (ANOVA) や t 検定など、実験セットアップに適したものを使用して、変化の有意性を確認することもできます！

  これらの手順を使用すると、たとえ移動中であっても、どこにいても qPCR 分析を行うことができます。 さらに簡単にするために、毎回使用する Excel のテンプレートを作成することができます。 そうすれば、あなたはデータを入力するだけで、その迅速な分析実施で周囲を驚かせることができるでしょう！

  原著：2016年7月9日発行。 2021年2月8日に見直し、更新しました。

  Further Reading

  Livak KJ, Schmittgen TD. RealTime Quantitative PCR and the 2^{-2DeltaC_{t}} を用いた相対的な遺伝子発現データの解析。 メソッド。 Methods. 2001;25:402-8.

  

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  Written by Suganth Kannan

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