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Abstract

腸内感染症は、特に発展途上国のHIV感染者（PLWHA）における病的状態と死亡率の大きな要因である。 本研究は、下痢を伴うHIV/AIDS患者における臨床的および微生物学的スペクトルを評価し、そのような病原体の発生と便の性状、HIV血清反応状態、CD4数との相関を調べるために実施された。 HIV血清陽性の被験者154人とHIV陰性対照者50人の便を、直接顕微鏡検査、糞便培養、血清検査（Clostridium difficile Toxin A、Cryptosporidium抗原、Entamoeba histolytica抗原ELISA）により調査した。 CD4 T細胞はFACS count（Becton Dickinson社製）を用いて計数した。 この調査では、男性優位であった（男性112名、女性42名）。 衰弱、腹痛、食欲不振が最も多い症状であった。 HIV血清陽性例ではコクシジウム寄生虫が下痢の原因として最も一般的であった． C. parvumが60.42%，Isospora belliが9.03%にみられた． 細菌性病原体ではC. difficileが18.06％，下痢原性Escherichia coliが11.11％，赤痢菌が2.78％で検出された． 病原体の分離率は，HIV血清陽性の症例やCD4 Tリンパ球数の少ない症例でより高かった． CD4 Tリンパ球数の定期的なモニタリングと腸管病原体のスクリーニングは，PLWHAのQOL向上に役立つと考えられる。 はじめに

ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染は、感染者に多大な苦痛を与え、特に発展途上国では医療制度に大きな負担を与えている。 インドのような貧困と疾病に苦しむ国にとって、HIV/AIDSの惨劇は最も不幸なことである。 免疫力の低下により、HIV血清陽性の患者が抱える大きな健康問題のひとつに日和見感染があり、病気の経過中に患者が微生物の動物園と化すことがしばしば見られる。 下痢は HIV/AIDS で非常によく見られる臨床症状の 1 つで、AIDS の症例を定義する基準として含まれています。 下痢のエピソードは、急性の短いもの、断続的なもの、再発性のもの、場合によっては慢性的で重度のものがある。 下痢は患者のQOLを著しく低下させ、持続する場合は脱水、栄養不良、体重減少を引き起こす可能性があります。 下痢は、先進国ではHIV/AIDS患者の50％、発展途上国では患者の100％に関連している。

AIDSにおける下痢の原因は、感染性のものと非感染性のものがある。 非感染性の下痢は、ART関連の副作用やHIV腸症が原因である可能性がある。 HIV/AIDSにおける感染性下痢は、寄生虫、細菌、ウイルス、真菌など様々な病原体によって引き起こされることが、いくつかの研究によって示されている。 HIV関連下痢症における腸管病原体の特定の組み合わせはなく、腸管病原体の地理的分布、流行性、季節変動、また患者の免疫状態により、患者ごと、国ごとに病因が異なる ……………………………………………………………………. これらの感染症のほとんどは治療可能であるため、患者ごとに直接顕微鏡検査、糞便培養、特異抗原および/または特異抗体を検出する血清検査などの診断ワークアップが必要である。

以上の背景から、本研究は、デリーだけでなく近隣のウッタルプラデシュ、ハリヤナ、パンジャブ、ヒマチャルプラデシュの患者を受け入れるデリー最大の三次医療病院で登録された下痢のHIV／エイズ症例の臨床および微生物スペクトルを評価するために実施された。 このような症例における下痢の微生物的病因を理解することで、適切な医学的調査、特定の治療、適切な栄養指導を行い、わが国におけるこの疾患に対する社会経済的・医療的コストを削減することを目的としています。 材料と方法

2.1. 研究対象者

インド、ニューデリーのMaulana Azad Medical Collegeに付属するLok Nayak病院のARTクリニックに通院する下痢のHIV血清陽性の成人被験者1504名を、ART状態にかかわらず本研究に募集した。 下痢のあるHIV血清陽性の被験者のうち、過去2週間に特定の下痢止め療法を受けていない者だけが登録された。 対照群として、年齢と性別を一致させ、無作為に選んだ下痢の症状を有する成人HIV血清陰性者50人も、ニューデリーのMaulana Azad Medical Collegeの微生物学研究所に便サンプルの定期検査のために来訪していた。 過去2週間に特定の下痢止め療法を受けていた被験者、および/またはHIVの状態が不明な被験者は、対照群から除外した。 研究デザイン

本研究は、2008年4月から2011年6月まで実施された。 AIDS患者とHIV血清陰性対照者における下痢の臨床的・微生物学的プロファイルを明らかにするための横断的分析であった。 登録時にインフォームドコンセントを取得し、各調査参加者に社会人口統計学的および個人的な詳細、下痢エピソードの既往、臨床症状などからなる質問票への記入を依頼した。 参加者全員から糞便検体の採取を依頼した。 検体は清潔な広口のスクリューキャップ付き使い捨てプラスチック容器に採取され、不必要な遅延を避けるために、患者自身がその日のうちに微生物学研究所に運んだ。 下痢の定義

下痢は、24時間以内に3回以上の緩いまたは水っぽい便通があることと定義した。 急性下痢症は、受診時に7日以内に続いた下痢症と定義した。 持続性下痢は、診察時に7日以上14日未満続いた下痢と定義された。 下痢が14日以上続く場合は慢性下痢とした。 実験室検査

すべての糞便検体は、一連の微生物学的検査に供された。 検体は、処理が遅れた場合、4℃で保存された。 便検体の色、硬さ、血液・粘液・虫の有無が記録された。 検体一杯を生理食塩水とルゴールヨードで乳化し，顕微鏡でEntamoeba histolytica, Giardia lamblia, RBC, pus cell, helminthic ova, cystの存在を観察した． 便の塗抹標本を作製し、熱固定し、グラム染色、キンユン染色（modified acid fast stain）、トリクロム染色で染色した。 すべての検体を直接培養するとともに，セレナイトFブロスおよびアルカリペプトン水で濃縮し，それぞれXylose Lysine Deoxycholate寒天培地およびBile Salt寒天培地にて培養した． Campylobacter jejuniの分離には、特殊な選択培地であるチャコールセフォペラゾンデオキシコール酸寒天培地（CCDA）を使用し、微好気性環境下で42℃、48時間培養を行った。 Aeromonas属菌とYersinia Enterocoliticaの分離には、便サンプルをそれぞれAeromonas選択培地とYersinia選択培地で培養した。 これらの菌は，コロニー特性，生化学的検査，および市販の特異的抗血清を用いたスライド凝集反応による血清学的検査に基づいて同定された． 便サンプル中のC. difficile Toxin A、Cryptosporidium抗原、E. histolytica抗原の検出は、市販のEnzyme Immunoassayキットで行った。

全参加者のCD4 Tリンパ球数はBecton DickinsonによるFACSカウントで求めた

2.5． 統計解析

腸管病原体の頻度と便の一貫性の相関を調べるために、Kruskal-Wallis検定が適用された。 腸管病原体の分離率とHIV血清反応状態、CD4 Tリンパ球数の関係を調べるために、カイ二乗検定とフィッシャーの正確検定を用いた。 結果

募集したHIV血清反応陽性者154名のうち、男性112名（72.73％）、女性42名（27.27％）であった。 64.94％の被験者が性的に活発な年齢層である26-35歳であった。 平均年齢は32.36歳で、18歳から68歳まで幅広い年齢層が対象となった。 対象者の大多数（23％）は非識字者であり、21.7％は小学校レベルまでの教育を受けていた。

表1は，症例募集時に記録された臨床症状による症例の分布を示している。 HIV血清陽性の症例では、衰弱、腹痛、食欲不振が下痢に関連する最も一般的な症状であり、HIV血清陰性の対照群では腹痛、嘔吐、発熱が最もよく訴えられた。

登録されたHIV血清陽性者154例のうち、糞便検体を提出したのは144例であった。 HIV血清陽性者の大部分（60.39％）は慢性下痢であったが（表2）、HIV血清陰性者の大部分（72％）は急性下痢であった。

表3は便の粘度と関連した分離した腸管病原体を示している． ある種の病原体（C. parvumとI. belli）は水様便で多く検出され、これは統計的に有意であった（P値＜5087＞0.05）。一方、細菌性病原体（C. difficile、下痢原性大腸菌、Shigella属）は形成便に有意に多く見られた（P値＜5087＞0.05）。 HIV血清陽性の症例では，下痢の原因としてコクシジウムが最も多く，C. parvumが60.42％の症例で検出された． 細菌性病原体ではC. difficileが18.06％の症例で陽性となり、トップとなった。 Candida albicansは25.69％の症例で分離されました。

表4は調査症例のHIVの状態に関連して腸管病原体の頻度を示したものである。 C. parvum，C. difficile，C. albicansはHIV血清陽性の調査症例ではHIV陰性の対照群に比べ有意に多かった（P値＜5087＞0.05）．

HIVの下痢の原因となる病原体の分離率は、CD4数が200cells/μL未満のHIV血清陽性者は、CD4数が200cells/μL以上のHIV血清陽性者と比較して全体的に高い。 しかし，表5に示すように，CD4が200cells/μL未満の患者では，C. parvum，I. belli，C. difficile，C. albicansのみ分離率が有意に高かった（P値 < 0.05）．

4.Discussion

Diarrhea is the second leading cause of hospital visit in the developing nations in patients with HIV/AIDS . AIDSにおける下痢の病因は多因子性である。 先進国では非感染性であるのに対し、発展途上国では感染性であることが予想される。 HIV/AIDSにおける下痢の病因については、北インドの各地域で多くの研究がなされている。 しかし、ニューデリーにおけるHIV/AIDS患者のCD4 Tリンパ球数および便の特徴と関連した下痢性病原体の分離に関する報告はほとんどない。 本研究は、ニューデリーの中心部に位置し、最も繁華で大規模な3次医療施設のHIV/AIDS患者の下痢の感染病因を明らかにするものである。 本研究ではまた、分離された下痢症の病原体とHIV血清反応状態、便の特徴、CD4 Tリンパ球数との相関を調べる。

本研究では、インドで行われた下痢症のHIV陽性患者に関する他の研究同様、男女比2.66 : 1で男性例が圧倒的に多い（154例中男性112例）ことが分かった。 男性患者が多いのは、仕事を求めて大都市（デリーはその一つ）に移住しているためと思われる。 配偶者と離れている期間が長いこと、男性が乱婚的であることなどが、HIV感染につながったものと考えられる。 また、インドの社会環境では、女性は仲間はずれにされ、家族のサポートを失うことを恐れて医療を受けようとしないため、男性が圧倒的に多いという事実があるのかもしれない。 本研究の参加者の平均年齢は32.36歳で、最も多い年齢層は26-35歳であった。 この年齢層は性的に活発であるため、より大きな影響を受ける。 同様の結果は南インドの研究でも得られており、下痢を伴うHIV血清陽性の年齢の中央値は34歳、平均年齢は36歳であった 。

本研究では、下痢を伴うHIV血清陽性の症例で最も頻繁に見られた臨床所見は、衰弱（64.93％）、腹痛（61.69％）、食欲不振（51.95％）であった。 これは，カンボジアのChhinらによる報告（HIV陽性下痢症例では腹痛（90.3％），発熱（86.7％），衰弱（80％）が最も多い）と類似している． HIV陽性者の下痢に関連する症状として，脱力感，食欲不振がHIV血清陰性対照群と比較して有意（P値＜5087＞0.05）に認められた（表1）． 慢性下痢はHIV陽性者でHIV陰性者に比べ有意に多かった（60.39％、P値< 0.05）（表2）。 北インドの別の研究では、HIV感染者の69.3％が慢性下痢であったと報告されている。 下痢を伴うHIV血清陰性群では嘔吐，発熱，悪心がより頻繁に認められ（統計的に有意な関連；P値 < 0.05），この群の被験者のほとんどが急性下痢であった（36/50；P値 < 0.05）。 これは、HIV陰性者の下痢は、発熱、吐き気、嘔吐を伴うことが多く、急性感染症が原因である可能性が高いためである。

我々の研究では、C. parvumとI. belliは水様便に多く、細菌性腸内病原体（C. difficile、下痢原性大腸菌、赤痢菌）は形成便に多く見られた（P値 < 0.05）。 また，ザンビアの研究では，HIV陽性下痢症例において，C. parvum，I. belli，G. lambliaへの感染は，便の水分量の増加と関連していると報告している． 水っぽい便で陽性率が高いのは，より侵襲性が高く悪性の腸管病原体に感染し，水っぽい下痢や排菌の増加につながる炎症がより生じたためと考えられる． HIV/AIDS患者の便の粘性を観察することは、腸管病因物質の推定診断に役立ち、陽性となる可能性が最も高い症例に寄生虫学的調査の照準を合わせることが可能になる。 チェンナイでの研究でも、下痢のHIV患者における腸内寄生虫の有病率が報告されている。 本症例で認められた微生物学的プロフィールは，インドの他の研究で報告されているものと典型的であり，腸球菌が最も多く分離され，中でもC. parvumが最も多く（症例の60.42％）検出された． HIV感染者の下痢症におけるクリプトスポリジウム陽性率は5.71％〜22.8％と報告されている（インド）。 本研究でCryptosporidium陽性率がかなり高いのは、Cryptosporidiumの検出方法としてModified Kinyoun’s methodとELISAの2つ以上の方法を用いたためと思われる。 また、ほとんどの症例が水様便、半水様便であったことが原因である可能性もある。 また、地理的・季節的な変動も、この寄生虫の流行に影響を与えることが分かっています。 クリプトスポリジウムは、AIDS患者に大量の水様性下痢を引き起こし、1日あたり最大10リットルの体液喪失をもたらすことがあります。 環境耐性のある小さなオーシスト、低い感染量（10-100オーシスト）、オーシストが消毒剤に耐性があることなどは、クリプトスポリジウム感染症の疫学に影響を与える要因の一部となっています。 クリプトスポリジウム感染症は有効な治療法がないため、特に免疫不全者では予後不良となることが多い。 Cyclospora（1.39％）およびMicrosporidia（0.69％）の分離率は極めて低かった。 この原因は、これらの病原体は断続的に排出されるため、提出された糞便サンプルに含まれていなかったか、あるいは経験の浅い顕微鏡技師によって見落とされた可能性があると思われる。 検出のためには、糞便サンプルの繰り返し検査が推奨される。 透過型電子顕微鏡、組織化学、免疫蛍光抗体染色、PCR法などの診断法により、臨床検体での検出が容易になるはずである。 Microsporidium（1.69％）、Cyclospora（1.69％）の検出率は低いが、インドでは41％、2.6％と高率であると報告する著者もいる …………………..。 Ascaris lumbricoidesは5.56％に認められ，これは下痢の際に腸管内容物が繰り返し洗浄され，糞便中に排出されるためと思われた． G. lambliaとE. histolyticaは3.7%と7.41%に認められた。 これらの寄生虫の存在は、環境の衛生状態の悪さを反映している。 これらの寄生虫は、免疫不全の宿主に慢性下痢症を引き起こすことが確認されている。 このことは、HIV感染者は日和見感染により繰り返し抗生物質治療を受けるため、C. difficileは下痢の原因となる一般的な腸内細菌であり、臨床医はHIV/AIDSにおける下痢の原因を探る際、特に抗生物質へのアクセスが規制されていない我々のような途上国でこの病原菌を鑑別診断として押さえておくべきことを示唆している。 ナイジェリアでの研究では、HIV陽性の入院患者および外来患者におけるC. difficile感染症の有病率はそれぞれ43％と14％であったと報告されている。 我々の研究では、C. albicansは25.69％の症例で見られた。 これは，免疫力の低下と抗生物質の頻回使用によるものと思われる． HIV陽性者の下痢症例ではC. albicansの分離率が36％と高いことが過去に当科で報告されている。

C. parvum，C. difficile，C. albicansはHIV陰性対照群に比べ有意に多かった（P値 < 0.05）。 このことは、AIDSにおける免疫不全状態がPLWHAをこのような感染症に罹患しやすくしており、いったん定着すると増殖の阻止や感染菌の排除ができなくなることを示唆している。 この知見は他の研究ともよく一致し、HIV/AIDSにおける一般的な観察である。

我々の研究では、CD4数が<200 cells/μLのHIV血清陽性患者は、特定の病原体への感染率が高く、これは表5に示すように統計的に有意であることがわかった。 これらの病原体の中で最も多かったのは、日和見主義の消化管寄生虫であるC. parvumとI. belliで、CD4レベルの低下で見られるように免疫システムのダウンレギュレーションがあるときに感染を引き起こすものであった。 HAARTの効果的な投与による免疫再構築により、CD4細胞数の増加とともに分離率は減少した。 これは、腸管病原体の分離率とCD4数の間に逆相関を見出したTuliらの研究結果と一致する。

5. 結論

本研究により、HIV陽性者の大半は慢性下痢症であり、その原因としてコクシジウム寄生虫が主要な病原体であり、水様便のある症例は病原体の検出率が高いことが明らかとなった。 また、CD4数が5087>200cells/μL未満の症例では分離率が高かった。

結論として、本研究はHIV/AIDSにおける下痢の原因となる腸管病原体の早期診断の重要性を強調し、下痢に関連する罹患率と死亡率の大幅な減少に寄与すると考えられる。 また，本研究は，便検体中の腸内細菌を同定するための適切な診断施設を設置し，HIV/AIDSの疾病負担が集中しているわが国の周辺保健所ですぐに利用できるようにする必要性を強調している。 このことは、遠方の都市部の研究所への便検体の輸送の遅れや、自覚のない患者側のモチベーションの低下が、本疾患に関連する症例の死亡に大きな役割を果たすことから、極めて重要である。 また、統計解析に協力してくれたSanjeev Saini博士に感謝したい。