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結果と考察

Spirogyraの共役は窒素含有量の低下や枯渇によって誘導されると報告されている（Grote 1977; Yamashita and Sasaki 1979; Simons et al.1984) 。 そこで、まず、培地から窒素を枯渇させることで共役を誘導することを試みた。 しかし、これはうまくいかなかった。 Grote (1977) は、純粋な無機クロストリウム培地で共役を誘導することを報告し、pH 値が重要であることを指摘した。 我々は、様々なpHの培地で藻類フィラメントを培養したが、共役は誘導されなかった。 また、その他の試験、様々な温度、様々な栄養分の枯渇も不成功であった。 Spirogyraの一部の種では、藻類フィラメントを連続照明下で培養することにより、共役を誘導することが報告されている（Yamashita and Sasaki 1979）。 しかし、窒素源なしで2週間連続照明下で培養しても、共役は見られなかった。 そこで、APWを用いた寒天培地上でフィラメントを23℃、12:12-hのL-Dサイクルで4日間培養し、共役を誘発させることに成功した。 また、培養中に末端細胞の遠位端に棒状のリゾイドが形成された。 寒天培地上のフィラメントを暗所で培養した場合，コンジュゲーション現象は起こらなかった。 Allen (1958)は，寒天培地上での培養によってコンジュゲーションが誘導されることを報告している。 彼女はPringsheimの土壌-水培地(Pringsheim 1946)を用いて、約20℃で16時間の光（クールホワイト蛍光管）-8時間の暗黒体制でストック培養を維持した。 交配誘導は、数本のフィラメントを蒸留水で調製した1.5% Difco寒天培地に移し、16:8時間のL-Dサイクル下で約20℃にて培養を行った。 数日間培養した後、接合胞子が寒天培地上に形成された。 光条件や培養温度は異なるが、Allenの方法（1958）と基本的に同じであった。 さらに、寒天培地上での接合誘発の要因を分析したところ、次のような結果が得られた。

粉末寒天に含まれる未知の汚染物質が接合誘発に関与しているのではないか、と考えた。 そこで、以下の実験により、その可能性を検討した。 粉寒天（和光、大阪、日本）をAPWに懸濁し、一晩撹拌しながら4℃に保った。 遠心分離（185×g, 10分）後、得られたペレットをAPWで2回遠心分離して洗浄した。 最終的に得られた寒天ペレットを新しいAPWに懸濁し、プレートを作製した。 この寒天培地プレートで、共役を誘導することに成功した。 粉寒天を洗浄した上澄み液で藻類フィラメントを培養した場合、コンジュゲーションは全く誘導されなかった（データは示さず）。 APWは窒素を含まないので，寒天培地には窒素がほとんど含まれていないはずである． そのため、寒天培地上の位置と窒素の枯渇という2つの要因が相乗的に作用して誘導された可能性がある。 そこで、APWに1mM KNO3を添加した寒天培地でフィラメントを培養した。 この寒天培地でもコンジュゲーションが誘導された（図1a）ことから、コンジュゲーションの誘導には窒素の枯渇が関与していないことがわかった。 さらに、様々な栄養素を含むクロストリウム培地を用いて作成した寒天培地上でも、フィラメントの共役を誘導した（図1b）。

S. castanaceaの場合と同様に、藻類のフィラメントを切断すると根粒が分化した他の種(データは示さず)であるS. fuluviatilisについても寒天プレート上での共役を誘発するかどうか検討した。 この種においても、APWを用いて調製した寒天培地上で培養することにより、共役化が誘導された。 さらに、根粒菌が分化しない3種のSpirogyraについて、寒天培地上での共役を検討した。 S.ellipsospora TranseauはChara培養のコンタミネーションとして実験室で維持されている。 琵琶湖で採取された他の2種のSpirogyra sp.は6ヶ月間軸培養として維持された。 この3種のSpirogyraは寒天培地上で培養しても共役を示さなかった。

いくつかのSpirogyra種では窒素含有量の低下または枯渇によって共役を誘発した(Grote 1977; Yamashita and Sasaki 1979; Simons et al. 1984)。 S. majusculeでは，窒素含有量に加えて，光強度やpHを制御する必要があった（Grote 1977）。 S. castanacea および S.fuluviatilis では，寒天培地での培養が有効であり，窒素の枯渇は必要なかった（本調査）。 一方，Agrawal and Singh (2002)は，Spirogyra sp.は2-10%寒天培地では抱卵を開始しなかったと報告している。 これは，根粒を分化させないSpirogyra sp.で得られた我々の結果と同様であった。 このように，Spirogyra sp.は根粒を分化させない種であり，抱合に必要な因子は種によって大きく異なることがわかった。 そこで、寒天培地上での共役形成の誘導に生育阻害が関与しているかどうかを検討した。 その結果，APW培地とクロステリウム培地のいずれの寒天培地でも，結合管乳頭の形成が始まらなければ，細胞分裂を経て増殖した。

フィラメント間の交配型の有無を調べるために，S. castanaceaの単クローン培養を行い，交配を誘導した． 48時間培養後、同じフィラメントに2種類の抱合型が認められた（図2a-c）。 図2bは、細胞が誘導した鱗片状抱合（図2aの矢頭）を示している。 一方、図2cは、細胞が横方向の結合を誘導している様子を示している（図2aの矢印）。 このとき、接合胞子は正常に形成された（Fig. 2d）。 山岸(1977)は、S.castanaceaでは一般的に鱗片状抱合は見られるが、側方抱合はほとんど見られないと報告している。 今回の結果はYamagishi (1977)の結果と一致した。 しかし、同じフィラメントに鱗片状共役と横方向共役の両方が生じることは、我々の知る限り初めての報告である（Fig. 2a）。 2つのフィラメントが対になったとき、ほとんどの場合、一方のフィラメントの細胞は雄として、他方のフィラメントの細胞は雌として振る舞った。 しかし、ごくまれに両方のフィラメントで接合胞子が形成されることがあった(Fig. 3)。 このように、少なくともS.castanaceaでは交配型が固定されていないことがわかった。 寒天培地上で約1ヶ月間培養することにより、低胚葉が形成された。 しかし、クロストリウム培地を加えても、再現性よく発芽を誘導することは困難であった。

S. castanaceaの各種レクチンを用いて交配過程で分泌される細胞外物質の同定を検討した。 検討した19種類のレクチン（BSL-I, BSL-II, Con A, DBA, DSL, ECL, jacalin, LEL, PHA-E, PHA-L, PNA, PSA, RCA I, SBA, SJA, STL, UEA I, VVL, WGA）のうち、BSL-1, Con A, jacalin, RCA-I とSBAは生殖細胞を染色したが、植物体は染色しなかった（Table 1）。 Yoonら（2009）は、S. varians (Hassall) Kützingの細胞外物質に対して、Con A、RCA、UEAの3つのレクチンがかなりのラベル化を示すと報告している。 このように、抱合時に分泌されるレクチン結合性物質は、種によってある程度異なるようである。 BSL-Iとjacalinは、jacalinが根粒の輪郭をはっきりと染めるのに対し、BSL-Iの染色は拡散しているという対照的な染色パターンを示すことを我々は以前に報告している（Inoue et al.1999、Ikegaya et al.2008b). このことから、BSL-I 結合物質がフィラメントの基質への接着に関与していることが示唆された。 一方、jacalin結合物質は、基質の認識に関与していると推測された（Ikegaya et al.2008b）。 そこで、本研究では、BSL-Iとjacalinに注目した（図4）。 寒天培地上で48時間培養したところ、図4aに示すようなフィラメントが様々な方向に乳頭を形成していることがわかった。 このフィラメントは、パートナーであるフィラメントが存在しない場合に、乳頭の形成を開始すると推測された。 BSL-I は乳頭の表面を強く染色した。 細胞間の隔壁も強く染色された。 次に、48時間培養後、共役を開始した一対のフィラメントを染色した。 Fig. 4b では、フィラメント下部の細胞の直径が上部フィラメントよりも大きいことから、上部フィラメントが雄性配偶子、下部フィラメントが雌性配偶子であると判断された。 また、対の細胞から伸長した共役管は強く染色され、雌性配偶子の細胞表面全体は弱く染色された（図4b′）。 72時間培養後、雄性配偶子の細胞表面全体も弱く染色された（図4c′）。 寒天培地上で96時間培養後、接合胞子が形成された（Fig.4d）。 接合管は強く染色され（Fig. 4d）、接合胞子の表面は染色されなかった。 次に、ジャカリンによる染色を検討した。 Fig. 3e のフィラメントの細胞は、同じ方向に乳頭を形成していた。 このフィラメントは、パートナーフィラメントの存在下で共役を開始し、スライドガラスに移す際に失われたものと推測された。 乳頭はジャカリンで強く染色されていた（Fig. 4e′）。 結合の過程では，ジャカリンは主に結合管を染色した（Fig. 4f′-h′）。 Con A、RCA-I、SBAによる染色パターンも検討した（データは示さず）。 Con Aは雌性配偶子で形成された接合胞の間の隔壁を強く染色し、乳頭は非常に弱く染色された。 接合胞子が形成された場合、図4d′に示すように、RCA-IまたはSBAのいずれかによる染色のパターンはBSL-Iのそれと類似していた。

6種類のレクチン、BSL-I, Con A, jacalin, RCA-I, SBA, WGAが結合に及ぼす影響を検討した。 フィラメントはいずれかのレクチンを添加したAPWで1日間プレインキュベーションした。 その後、同じレクチンを添加した寒天培地に移し、4日間培養した。 その結果、jacalinは接合胞子の形成を強く阻害したが、他は阻害しなかった（data not shown）。 系統的な解析の結果、jacalinは乳頭形成のごく初期の段階を強く阻害することがわかった（Fig.5）。 次に、jacalinによる阻害の可逆性を調べた。 フィラメントは、ジャカリン添加APWで1日、ジャカリン欠乏APWで1日、順次インキュベートした。 その後，ジャカリン不足の寒天培地プレートで4日間培養した。 しかし、乳頭は全く形成されなかった。 この不可逆的な阻害は、jacalin の強い結合に起因している可能性がある。 Yoonら（2009）は、RCAとUEAが抱合反応を阻害することを報告した。 しかし、彼らは阻害のステップを特定しなかった。 BSL-I、RCA-I、Con A、SBAもコンジュゲーションチューブを染色するが、その形成を阻害することはなかった。 BSL-I、RCA-I、SBAが認識する物質の役割については今後の研究課題である。