Abstract
De acetyleringsmechanismen van verschillende geselecteerde typische substraten uit experimenten, waaronder arylamines en arylhydrazines, worden onderzocht met de dichtheidsfunctionaaltheorie in dit artikel. De resultaten geven aan dat alle overgangstoestanden gekarakteriseerd worden door een vier-ledige ringstructuur, en dat hydralazine (HDZ) het meest krachtige substraat is. De bioactiviteit van alle verbindingen neemt toe in een opeenvolging van PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ. Het conjunctie-effect en de delokalisatie van de lone paren van het N-atoom spelen een sleutelrol in de reactie. Alle resultaten zijn consistent met de experimentele gegevens.
1. Inleiding
De arylamine N-acetyltransferases (NATs, EC 2.3.1.5) zijn fase II metabolisme-enzymen die zowel in prokaryoten als in eukaryoten voorkomen. De N-acetyleringsreactie leidt tot de detoxificatie van arylamine xenobiotica en leidt uiteindelijk tot elektrofiele arylnitrenium ionen, die verantwoordelijk worden geacht voor DNA adduct vorming . Tot op heden vertonen de twee functionele NAT isozymen, NAT1 en NAT2, grote verschillen in substraatspecificiteit en weefseldistributie, ondanks 81% aminozuursequentie-identiteit. Het laatste, NAT2, komt voornamelijk tot expressie in de lever en het darmepitheel. Eerdere studies hebben verondersteld dat NATs een acetyloverdracht katalyseren via een klassiek ping-pong kinetisch mechanisme (Schema 1). Site-directed mutagenesis analyse van humaan NAT2 en Salmonella typhimurium NAT (StNAT) suggereerde dat een cysteïneresidu in de actieve site verantwoordelijk was voor het mediëren van het acetylatieproces. Recente presteady-state en steady-state kinetische studies van p-nitrofenylacetaat (PNPA) en NAT2 toonden aan dat het katalytisch mechanisme van NAT2 zou kunnen afhangen van de vorming van een thiolaat-imidazolium paar. Hoewel het enzym zowel in eukaryoten als prokaryoten wordt aangetroffen, is de endogene rol van NATs nog onduidelijk. Uit de substraatbepaling bleek dat zowel arylamines als arylhydrazines door NATs geacetyleerd kunnen worden. De vereiste stappen in de acetyltransferreactie bestaan uit de overdracht van de acetylgroep van het actieve cysteïneresidu naar het substraat, en de verwijdering van één proton van het substraat naar het substraat. In dit artikel is een gedetailleerde theoretische studie beschikbaar over het gedrag van arylamines en arylhydrazinesubstraten in acetylering, met inbegrip van de eigenschappen van hun structuren, de overgangstoestanden, de profielen van energieën.
De NATs gekatalyseerde acetyloverdrachtsreactie.
2. Methoden
Alle berekeningen werden uitgevoerd met de B3LYP-methode van de dichtheidsfunctionaaltheorie (DFT) zoals geïmplementeerd in het Gaussian03 programmapakket , die eerder met succes is toegepast op een aantal enzymatische systemen. Wanneer 6-31G* en 6-311+G (3df, 2p) basissets werden gebruikt, werd de voorkeur gegeven aan de B3LYP hybride functie boven Hartree-Fock (HF) en MP2 methoden. Hoewel het soms faalt in de behandeling van dispersie-rijke interacties, is de B3LYP methode met succes toegepast op vele biologische systemen .
De geometrieën van alle reactanten, tussenproducten, en producten zijn geoptimaliseerd op het B3LYP/6-31G* niveau van de theorie. De meest stabiele conformatie en hun energieën bij elke equilibratie en overgangstoestanden zijn uitgezocht. Frequentieberekeningen zijn uitgevoerd voor alle resulterende stationaire punten en elke overgangstoestand heeft slechts één denkbeeldige frequentie. Bovendien is de MP2/6-311+G** methode toegepast op de geoptimaliseerde structuren van de stationaire punten om nauwkeuriger energieprofielen te verkrijgen. Indien niet speciaal aangegeven, alle volgende energie-analyses verwijzen naar de resultaten van MP2/6-311+G**//B3LYP/6-31G (d) berekeningen.
3. Resultaten en Discussie
3.1.
Zes substraten, p-aminobenzoëzuur (PABA), 4-methoxylaniline (4-MA), 4-aminosalicylaat (4-AS), 5-aminosalicylaat (5-AS), isoniazid (INZ), hydralazine (HDZ), zijn geselecteerd volgens de referenties , die kunnen worden onderverdeeld in twee verschillende families: arylamines en arylhydrazines. De energieën voor grensobitals (inclusief HOMO-2, HOMO-1, HOMO, LUMO, LUMO+1 en LUMO+2) van alle zes substraten zijn vermeld in tabel 1, die geacht worden een belangrijke rol te spelen in bio-enzymatische systemen. Voor de arylamines worden de HOMO energieën verlaagd in een volgorde van 4-MA > 5-AS > PABA > 4-AS, wat wijst op de toename van hun nucleofiele reactiviteit. Van alle zes substraten (zie figuur 1 in het aanvullend materiaal dat online beschikbaar is op doi: 10.1155/2009/783035), heeft INZ de grootste energiekloof tussen HOMO en LUMO, wat wijst op zijn stabiliteit. De Natural Population Analysis (NPA) resultaten toonden aan dat de actieve amino N atomen voor de arylamines familie elektronegatiever zijn dan die van de hydrazines groep, wat voornamelijk wordt veroorzaakt door het conjugatie-effect.
Hoewel PABA en 4-AS verschillende substituties hebben op de p-plaats van de aminogroep aan de zes-ledige ring, zijn hun bio-activiteiten bijna gelijk. Een intermoleculaire H-bond zal het substraat zelf stabiliseren met een energiedaling van ongeveer 19-21 kJ/mol. Zowel de HOMO als de LOMO energieën voor 5-AS zijn hoger dan die van 4-A𝑆s, wat suggereert dat de eerste reactiever is dan de laatste.
Voor de arylhydrazinesubstraten zal het lone paar van de N-atomen aan de ruggengraat van de zes-getalige ring worden gedelokaliseerd in het hele systeem om de stabiliteit te vergroten. De 𝐸(𝐿-𝐻)-waarden van HDZ is 0,0318 a.u. hoger dan die van INZ, wat duidt op zijn hogere reactiviteit dan de laatste.
3.2. De verschillende routes en overgangstoestanden
In principe kunnen alle substraten reageren met het actieve cysteïneresidu via een gecoördineerde route of een stapsgewijze route. In het eerste geval is er in de overgangstoestanden (zie figuren 1 en 2, con-ten) een gecoördineerde overdracht van de waterstof H5 naar het S1 atoom van cysteïne en een bindingsvorming tussen N4 en C2 atomen. Het verbreken van oude bindingen (N4H5 en S1C2) en de vorming van nieuwe (C2N4 en S1H5) vinden gelijktijdig plaats. De reactanten en de doelproducten zijn verbonden door de enige overgangstoestand op het potentiële energieoppervlak (PES). De hoofdstructuurgegevens van alle overgangstoestanden zijn vermeld in tabel 1 van het aanvullend materiaal. Voor het stapsgewijze mechanisme wordt het H5-atoom eerst overgeplaatst naar het O3-atoom van de carbonylgroep, waardoor een nieuwe binding ontstaat tussen N4 en C2-atoom via overgangstoestand stw-ts1. Vervolgens zal een thiolester tussenproduct (intmed) worden gevormd. Vervolgens vindt de tweede migratie van H5 plaats van de hydroxylgroep naar S1-atoom via stw-ts2 samen met de verbreking van de binding S1-C2, die uiteindelijk leidt tot de producten.
De gecoördineerde en stapsgewijze routes voor arylamine N-acetyltransferases gekatalyseerde reactie.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
De structuur van de overgangstoestanden voor zowel de gecoördineerde als de stapsgewijze route van PABA.
Uit de resultaten blijkt dat alle overgangstoestanden worden gekenmerkt door een vierhoekige ringstructuur die bijna planair is. Er zijn twee kleine hoeken kleiner dan 80° in elke overgangstoestand (C2S1H5 en S1C2N4 voor con-ts, C2O3H5 en C2N4H5 voor stp-ts1, C2S1H5 en S1C2O3 voor stp-ts2), die grote rek brengen in het hele systeem en het onstabiel maken. Onder de zes gecoördineerde overgangstoestanden (con-ts) van alle substraten zijn de eigenschappen van de binding C2N4, N4H5 en S1H5 ruwweg gelijk voor alle substraten, terwijl de interactie tussen S1 en C2 een van de bepalende factoren is voor de gecoördineerde stap.
De dingen worden anders voor de stapsgewijze paden. De hybridisatieveranderingen van het C2-atoom volgen een soortgelijke tendens (𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3) voor alle substraten tijdens de stapsgewijze acetylering (aanvullende tabel 1). De eerste migratie van H5 leidt tot de overgangstoestand stp-ts1, en vervolgens bevindt zich een tussenproduct met de naam intmed op het potentiële energieoppervlak (PES), dat een lokaal minimum is. Het is een tetrahedraal thiolester intermediair zoals voorgesteld in eerdere experimentele studies. Het is kortlevend en een daaropvolgende H5-overdracht zal spoedig plaatsvinden via overgangstoestand stp-ts2. Voor de stapsgewijze route verschillen de structuren van de overgangstoestanden voor verschillende substraten zeer weinig met andere. De 3D-structuren van de overgangstoestanden werden opgesomd voor PABA (figuur 2), de andere waren vergelijkbaar met die.
3.3. De energieën
De relatieve energieën van alle mogelijke routes voor de zes substraten zijn uitgevoerd op basis van de energiesom van de reactanten die als nul is genomen (figuur 3). Uit figuur 3 blijkt dat de gecoördineerde routes gunstiger zijn dan de stapsgewijze. De energiebarrières van de gecoördineerde overgangstoestanden (con-ts) zijn lager dan die van de stapsgewijze (stp-ts1) in een bereik van 83,5 kJ/mol tot 26,9 kJ/mol (aanvullende tabel 2). De arylhydrazines zijn betere substraten dan de arylamines, en HDZ is de meest reactieve met de laagste activeringsenergie, hetgeen goed overeenkomt met de experimentele gegevens. Deze conclusie kan ook worden getrokken uit de analyse van de structuurgegevens (aanvullende tabel 1). Het versterkte conjunctie-effect en de delokalisatie van de stikstof-lone paren aan de ruggengraat stabiliseren de overgangstoestand. De bioactiviteit voor alle substraten wordt verhoogd in een sequentie van PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ.
De energieprofielen voor alle substraten.
4. Conclusies
De volgende conclusies kunnen worden getrokken.
(i)Alle substraten kunnen worden geacetyleerd via twee verschillende routes: de gecoördineerde en de stapsgewijze, en de eerste heeft sterk de voorkeur vanwege de lagere activeringsenergieën.(ii)Uit onze berekening blijkt dat arylhydrazinen betere substraten zijn dan de arylaminen, en HDZ is de meest reactieve met de laagste activeringsenergie. De bioactiviteit voor alle substraten neemt toe in een volgorde als PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ, wat zeer goed overeenkomt met de experimentele resultaten. (iii) Het conjunctie-effect en de gedelokaliseerde lone pairs spelen een zeer belangrijke rol in acetylatie. Het versterkte conjunctie-effect en het toenemende aantal van de eenzame paren aan de zes-ledige ring zullen leiden tot de lagere energiebarrière.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Scientific Foundation van China (no.20603030, no.20873074, en no.10674114), 973 project van het Ministerie van Wetenschap en Technologie van China (no. 2009CB930103), de Natural Scientific Foundation van de provincie Shandong (no. Q2008B07), en de Stichting voor Creatieve Onderzoeksgroepen van Ludong University (no. 08-CXA001).
Aanvullend materiaal
Voor de lengtebeperking van dit artikel werden de 3D-structuren van alle arylamines en arylhydrazinesubstraten, de hoofdstructuurgegevens voor alle overgangstoestanden en de relatieve energieën voor verschillende paden verzameld in het aanvullend materiaal.
- Aanvullend materiaal