Free Press

INTRODUCTION

Animal models play an important role in drug development and studies of molecular biological mechanisms. Historycznie, model raka skóry wywołanego smołą węglową u królika zapoczątkował rozwój modelu mysiego wywołanego czynnikami rakotwórczymi. Różne modele zwierzęce zostały ustanowione jako narzędzia oceny do przewidywania czynników rakotwórczych i badania mechanizmów rakotwórczych (1). Jednak podejście polegające na stosowaniu przewlekłej ekspozycji na czynnik rakotwórczy jest czasochłonne i kosztowne, co ogranicza jego zastosowanie w opracowywaniu leków. Niemniej jednak, modele mysie są nadal bardziej atrakcyjne niż modele dużych zwierząt ze względu na niski koszt, łatwość obsługi i znaną informację genetyczną (2). Ostatnio opracowano syngeniczny model mysi, do którego wstrzykuje się linie komórkowe myszy (3). Zaletami tego modelu są powtarzalność, możliwość łatwego wywoływania różnych typów nowotworów i immunokompetencja. Z drugiej strony, model ten często wykazuje inną odpowiedź w porównaniu z wynikami badań in vitro na ludzkich komórkach nowotworowych. Aby przezwyciężyć tę wadę, National Cancer Institute (NCI) zastosował metodę, w której ludzkie komórki nowotworowe są wstrzykiwane do myszy z obniżoną odpornością. Z ośmiu różnych linii komórek nowotworowych NCI (raka mózgu, okrężnicy, białaczki, płuc, czerniaka, jajnika, prostaty i nerki) opracowano zestaw modeli ksenograftów. Ponadto, opracowano różne metody generowania modeli mysich w celu oceny skuteczności i toksyczności nowych leków. Jednym z modeli jest genetycznie modyfikowany model mysi (GEMM), który jest zaawansowaną metodą oceny mechanizmów kancerogenezy i lekooporności (4). W modelu GEMM wykorzystywane są myszy immunokompetentne, podobnie jak w modelu syngenicznym. Model ten pozwala więc na zastosowanie immunologicznego adiuwanta w rozwoju nowotworów. Co więcej, model ten jest przydatny do wyjaśniania procesów biologicznych oraz badania komórek nowotworowych i ich mikrośrodowiska, ale jest bardzo drogi, heterogeniczny i skomplikowany. Dodatkowo, częstotliwość występowania guzów, ich rozwój i wzrost nie pokrywają się w modelu GEMM (4-7). Wielu badaczy opracowało strategię przedklinicznej oceny w celu określenia potencjału terapeutycznego i naśladowania ludzkiego środowiska nowotworowego. Oprócz modelu GEMM, modele ksenograftowe in vivo wykorzystują atymiczne myszy nagie i myszy z ciężkim połączonym niedoborem odporności (SCID) do wszczepiania ludzkich komórek nowotworowych lub tkanki guza pacjenta w badaniach translacyjnych w celu przeprowadzenia prób klinicznych (8,9). W tym przeglądzie, rodzaje i cechy modeli ksenograftów nowotworowych są skoncentrowane na wykorzystaniu w rozwoju leków przeciwnowotworowych.

Ektopowy model ksenograftów nowotworowych. Ogólnie rzecz biorąc, ludzkie komórki nowotworowe są wstrzykiwane podskórnie do tylnej nogi lub grzbietu myszy (Rys. 1A). W modelu ksenograftowym guza ektopowego (model ektopowy), miejsce przeszczepu jest inne niż pochodzenie hodowanych komórek. Model ektopowy jest standardowym modelem nowotworu używanym do walidacji i oceny w badaniach onkologicznych. Po utworzeniu nowotworowych linii komórkowych do badań przesiewowych w NCI, opracowano modele ksenograftowe wywodzące się z tych linii komórkowych. Sześćdziesiąt linii komórkowych pochodzących z ośmiu narządów zostało wykorzystanych do stworzenia modeli ksenograftów, a informacje takie jak czas podwojenia guza i wskaźnik tumorogenności zostały przedstawione w raporcie (1). W Tabeli 1, w ludzkich nowotworowych liniach komórkowych, odtwarzalny wskaźnik przyjęcia modelu ksenograftowego wynosił ponad 90%. Do oceny związków ołowiu uzyskanych z badania przesiewowego in vitro, model ten wykazał, że te same komórki nowotworowe mogą być użyteczne i przewidywalne, co jest pomocne przy wyborze odpowiedniego związku nowotworowego do tłumaczenia na badania kliniczne.

Ponieważ model ektopowy może być używany do łatwego monitorowania tumorogenności i wzrostu guza, wielu badaczy wykorzystało ten model do oceny skuteczności przeciwnowotworowej (10-12). Objętość guza (V) jest obliczana na podstawie największej długości i najkrótszej długości guza (Równanie1). Na podstawie kilku parametrów opartych na tych danych można ocenić aktywność przeciwnowotworową. Wykorzystano stosunek grupy leczonej (T) do grupy kontrolnej (C) (optymalny % T/C), opóźnienie wzrostu guza i regresję guza (13-15). Określono zgony związane z lekiem (DRD) i zmianę masy ciała jako parametry toksyczności. Jako DRD przyjęto zgony zwierząt w ciągu 15 dni, a ponad 20% utratę masy ciała leczonych myszy w stosunku do kontroli uznano za działanie niepożądane.

Parametry te pomagają w wylosowaniu związku wiodącego z badań przesiewowych leków. Czasami odpowiedź na lek w zależności od typów nowotworów może być porównywana bez różnic indywidualnych, ponieważ dwa typy komórek nowotworowych mogą być spontanicznie przeszczepione do tej samej myszy, a dwa guzy mogą wykazywać różnice we wzroście (16). Ponadto, model ektopowy jest bardzo odtwarzalny, jednorodny i łatwy do zastosowania.

Jednakże nie wszystkie guzy mogą być użyte jako narzędzie oceny, ponieważ niektóre guzy wykazują martwicę podczas tumorigenicity, a niektóre guzy nie są lite (unsubstantial). Myszy w immunosupresji używane do tworzenia modeli zwierzęcych reprezentują inne mikrośrodowisko niż mikrośrodowisko ludzkiego raka. Dlatego ocena inwazji i przerzutów jest ograniczona w tym modelu.

Ortotopowy model ksenograftów nowotworowych. Alternatywne modele do oceny wrażliwości guza zostały opracowane. Ortotopowy model ksenograftu guza (model ortotopowy) jest zaawansowanym narzędziem, ale opiera się na immunosupresyjnym mikrośrodowisku myszy. W modelu ortotopowym, ludzkie komórki nowotworowe są przeszczepiane w to samo miejsce pochodzenia guza. Na przykład, komórki raka płuc były bezpośrednio wstrzykiwane do płuc myszy w modelu ortotopowym (Ryc. 1B). W tym modelu, aby zapewnić powtarzalność, wymagany jest dobrze wyszkolony ekspert z umiejętnościami chirurgicznymi. Trudno jest obliczyć tempo wzrostu nowotworów, ponieważ prawie wszystkie guzy, z wyjątkiem czerniaka, są niewidoczne gołym okiem. Co więcej, modele ortotopowe są ograniczone do pomiaru wzrostu guza bez poświęcenia, w przeciwieństwie do podskórnych modeli ektopowych. Do tej pory obrazowanie jest wybraną metodą monitorowania progresji rosnących guzów w modelach ortotopowych. Obecnie modele ortotopowe z liniami komórek nowotworowych wykazujących ekspresję fluorescencji lub lucyferazy są obserwowane za pomocą obrazowania optycznego, tomografii komputerowej (CT) lub rezonansu magnetycznego (MRI) (17). Do oceny kancerogenezy i określenia wzrostu guza bez ofiar wymagany jest drogi sprzęt, dlatego dostępność tego modelu jest ograniczona. Niemniej jednak, model ten jest klinicznie istotny z punktu widzenia procesu progresji przypominającego pacjenta (np. inwazja). Według raportu Ho i jego współpracowników, guzy ortotopowe wykazują szybszy wzrost guza we wczesnym stadium, angiogenezę i nadprzepuszczalność naczyń krwionośnych w porównaniu z guzami ektopowymi (18). W niektórych typach nowotworów obserwowano również przerzuty. Na przykład, ortotopowy model implantu guza opuszki tłuszczowej sutka jest również dobrym modelem dla raka piersi. W tym modelu spontaniczne przerzuty guza przypominają naturalną progresję ludzkiego raka piersi (19). Dlatego też aktywność przeciwnowotworowa i hamowanie przerzutów mogą być oceniane w tym samym modelu. Model przerzutów jest szczegółowo opisany poniżej.

Metastatyczny model raka. Guzy, które tworzą się lokalnie w wyniku ekspozycji na promieniowanie ultrafioletowe, jonizujące i czynniki rakotwórcze, krążą w naczyniach i węzłach chłonnych poprzez inwazję, powodując przerzuty (rak wtórny) w miejscach, które są podatne na inwazję. Zgodnie z hipotezą nasion i gleby Pageta, pierwotna komórka nowotworowa (nasienie) inicjuje przerzuty w odpowiednim środowisku (gleba), takim jak płuco, wątroba, kość, limfa i mózg (20). Ostatnie badania pobudziły rozwój inhibitorów przerzutów i leków zapobiegawczych opartych na badaniach mechanizmów przerzutów, ale nie było narzędzia oceny przedklinicznej, aby określić wytyczne do zatwierdzenia badania klinicznego.

Do ustanowienia modelu przerzutów opracowano różne metody i istnieją dwa rodzaje ludzkich modeli ksenograftów. Po pierwsze, w transplantacji ortotopowej, przeszczepione komórki nowotworowe dają początek pierwotnemu guzowi, guz jest usuwany, a następnie obserwuje się przerzuty. Na przykład, komórki czerniaka WM239 przeszczepiono myszom z ciężkim połączonym niedoborem odporności (SCID) i po 4 tygodniach wyizolowano guz pierwotny. Następnie obserwowano przerzuty do płuc (21). Model ortotopowy wykonano z komórek raka prostaty (DU145), a usunięty węzeł chłonny hodowano i wyizolowane komórki nowotworowe ponownie wstrzykiwano myszom, aby uzyskać model przerzutów (22). Po drugie, komórki nowotworowe wstrzykiwano dożylnie myszom nagim (ryc. 1C) lub SCID, gdzie krążyły jak nowotworowe komórki macierzyste i wywoływały przerzuty (23). Model ten jest generowany szybciej niż model pierwszy. W hybrydzie modelu ektopowego i ortotopowego, komórki HT- 29 (ludzki rak jelita grubego) wykazujące fluorescencję wstrzykuje się podskórnie w miejsce ektopowe, a kilka fragmentów guzów pochodzących z komórek HT-29 przeszczepia się do jelita grubego, po czym obserwuje się przerzuty (24). Generalnie, model przerzutów łatwiej jest uzyskać u myszy SCID niż u myszy nagich. Ponieważ przerzuty, podobnie jak w modelu ortotopowym, są trudne do zaobserwowania w wyglądzie, z wyjątkiem raka skóry (25), wykorzystano genetycznie zmodyfikowane linie komórkowe (komórki fluorescencyjne (24) lub komórki wykazujące ekspresję lucyferazy (26)) i monitorowano je za pomocą obrazowania optycznego in vivo. Często model ten jest stosowany w terapii, która polega na obrazowaniu za pomocą MRI lub pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) (27) w celu jednoczesnego postawienia diagnozy i określenia odpowiedniej terapii przeciwnowotworowej. Dotychczas nie ustalono wytycznych dotyczących wykorzystania przerzutów jako narzędzia oceny w opracowywaniu leków. Konieczne są dalsze badania nad powtarzalnością, mechanizmami leżącymi u podstaw przerzutów oraz markerami.

Patient-derived tumor xenograft model. Modele ksenograftów, pomimo swoich zalet, mają ograniczoną zdolność do wykazania, w jaki sposób pacjent z nowotworem odpowie na określone leczenie. Niezbędne jest wiarygodne przewidywanie odpowiedzi na lek w badaniu klinicznym, a obecne modele nie są wystarczające. W celu rozwiązania problemów związanych z wadami tych modeli, opracowano i wykorzystano PDTX (patient-derived tumor xenograft) (28,29). Ponieważ PDTX polega na transplantacji tkanki pacjenta z nowotworem bezpośrednio do myszy z obniżoną odpornością (ryc. 1D), informacje genetyczne i markery immunohistologiczne są skorelowane z pacjentem i mogą być stosowane do oceny nowych leków przeciwnowotworowych (30) i spersonalizowanych terapii przeciwnowotworowych. Szereg zalet PDTX można podsumować w następujący sposób: 1

Model PDTX ma jednak ograniczenia techniczne, jest kosztowny i czasochłonny. Przede wszystkim, świeżo wycięte pierwotne guzy ludzkie powinny być dostarczone z sali operacyjnej do laboratorium w ciągu kilku godzin. Równocześnie próbka pierwotnych ludzkich guzów powinna być poddana analizie immunohistologicznej. Dlatego konieczna jest współpraca pomiędzy chirurgiem, histologiem i badaczem. Następnie, oryginalne pierwotne ludzkie guzy mogą być porównane z tkankami nowotworowymi pasywowanego przeszczepu. Co więcej, wymagana jest zgoda instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB), ponieważ wykorzystanie tkanki nowotworowej pochodzącej od pacjenta wiąże się z rozważaniami klinicznymi i etycznymi. Niezależnie od tych wysiłków, wskaźnik przyjęcia PDTX wynosi około 25% (31-33), a ustanowienie PDTX zajmuje około trzech miesięcy do pierwszego przejścia (dane nie pokazane). Podobnie jak w przypadku przeszczepiania ksenonarządów, wymagana jest pierwsza transplantacja do myszy SCID, aby uniknąć ostrego odrzucenia immunologicznego, a to jest kosztowne. Dodatkowo, objętość tkanki nowotworowej pochodzącej od pacjenta jest bardzo ograniczona, więc liczba populacji PDTX powinna być zwiększona poprzez pasaż tkanki nowotworowej.Jednocześnie, każdy pasaż tkanki nowotworowej powinien być analizowany histopatologicznie i porównywany z oryginalną tkanką. Od drugiego pasażu można wykorzystywać nagie myszy. Kawałki tkanek guza mogą być zamrożone i zachowane w ciekłym azocie.

Pomimo tych przeszkód, ustanowiony model PDTX jest dostępny do walidacji wrażliwości na leki przeciwnowotworowe i przewidywania rokowania pacjentów. PDTX jest z pewnością niezwykle obiecującym modelem dla spersonalizowanej terapii przeciwnowotworowej. W związku z tym, światowe ośrodki badawcze zajmują się tworzeniem banku zasobów PDTX. W ciągu ostatniej dekady model PDTX rozwijał się bardzo dynamicznie. Model ten jest obiecującym narzędziem do rozwoju leków przeciwnowotworowych i biomarkerów predykcyjnych.

.