You are at the airport burning away time with a report due tomorrow morning for your professor. Você tem os seus dados. Por que não aproveitar o tempo e calcular a mudança da dobra de expressão para os genes que você testou naquele primeiro experimento qPCR que fez na semana passada?
É fácil – vou mostrar como.
Check Your Method
Existem duas formas principais de analisar os dados qPCR: análise de duplo delta Ct e o método da curva padrão relativa (método Pfaffl). Ambos os métodos fazem suposições e têm suas limitações, então o método que você deve usar para sua análise dependerá do seu projeto experimental.
A análise de duplo delta Ct assume que:
- a eficiência do primer é igual entre os conjuntos de primers (ou seja dentro de 5%);
- é quase 100% de eficácia de amplificação dos genes de referência e dos genes alvo;
- os genes de controle interno são constantemente expressos e não são afetados pelo tratamento.
O método geralmente atende a experimentos com um grande número de amostras de DNA e um baixo número de genes a serem testados.
O método da curva padrão relativa assume que:
- existem eficiências iguais entre o controle e as amostras tratadas.
Este método funciona melhor se você tiver menos amostras de DNA, mas um número maior de genes a serem testados.
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O que você precisa para a Análise Ct Delta Dupla
- qPCR valores Ct (dados brutos) para:
- o gene de controle e condições experimentais;
- o gene de interesse: controle e condições experimentais;
- Uma planilha de Excel.
E é isso! Nenhum software caro é necessário.
Aqui está um resumo rápido dos principais passos na análise do duplo delta Ct (para uma explicação detalhada leia este artigo).
4 Passos para a análise do duplo delta Ct
1. Pegue a média dos valores Ct para o gene de Housekeeping e o gene sendo testado nas condições experimentais e de controle, retornando 4 valores. Os 4 valores são Gene em teste Experimental (TE), Gene em teste de controle (TC), Gene de Housekeeping Experimental (HE), e Housekeeping Gene Control (HC).
| Valor Ct médio experimental | Valor Ct médio experimental | Valor Ct médio controlado | Valor Ct médio controlado | Valor Ct médio controlado | Valor DeltaCt (Experimental) | \DeltaCt Valor (Controlo) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| TE | HE | TC | HC | >DeltaCTE | \DeltaCTC | |
| 21.27 | 20,23 | 19,60 | 19,27 | 1,03 | 0,33 |
2. Calcular as diferenças entre os valores experimentais (TE – HE) e os valores de controle (TC – HC). Estes são os seus valores \DeltaCt para as condições experimentais (\DeltaCTE) e controle (\DeltaCTC), respectivamente.
3. Em seguida, calcule a diferença entre os valores \DeltaCTE para as condições experimentais e controle (\DeltaCTE – \DeltaCTC) para chegar ao valor delta duplo Ct (ddCt).
4. Como todos os cálculos estão na base logarítmica 2, cada vez que há o dobro de ADN, os seus valores Ct diminuem 1 e não irão diminuir para metade. Você precisa calcular o valor de 2^{-2\Delta}Delta C_{t}} para obter a mudança da expressão fold.
| dCt Valor (Experimental) | dCt Valor (Controle) | ddCt Valor | Mudança de Dobra de Expressão |
|---|---|---|---|
| dCTE | dCTC | ddCt | 2^-ddCt |
| 1.03 | 0,33 | 0,70 | 0,615572207 |
O que significa o valor?
Agora que você tem o seu valor para a mudança de dobra, o que é que isso realmente significa? Este valor é a mudança de dobra do seu gene de interesse na condição de teste, em relação à condição de controle, que foi normalizada para o seu gene de manutenção da casa.
Para torná-lo um pouco mais claro – você pode pensar sobre isso como uma porcentagem. Uma mudança de dobra de 1 significa que há 100% tanta expressão genética na sua condição de teste quanto na sua condição de controle – portanto não há mudança entre o grupo experimental e o grupo de controle. Um valor de dobra acima de 1 mostra a upregulação do gene de interesse em relação ao controle (mudança de 1,2 vezes = 120% de expressão gênica em relação ao controle, 5 = 500%, 10 = 1,000%, etc.). Valores abaixo de 1 são indicativos de downregulation do gene em relação ao controle (mudança de 0,5 vezes = 50% de expressão do gene em relação ao controle, portanto metade da expressão como no controle, etc.).
Você pode apresentar estes dados como gráficos de barras de mudança dobrável, fazendo um gráfico das condições de controle igual a 1. Você também pode usar análises estatísticas para verificar o significado das mudanças, por exemplo, usando uma análise de variância (ANOVA) ou testes t, o que for apropriado para sua configuração experimental!
Usando estes passos você pode conduzir sua análise qPCR onde quer que você esteja, mesmo que você esteja em uma viagem de carro. Para tornar as coisas ainda mais fáceis, você pode criar um modelo do Excel para usar a cada vez. Então você só terá que inserir seus dados e surpreenderá os outros com sua alacridade na condução de análises!
Publicadoriginalmente em 9 de julho de 2016. Revisado e atualizado em 8 de fevereiro de 2021.
Outras Leituras
Livak KJ, Schmittgen TD. Análise de Dados Relativos de Expressão Genética Usando PCR Quantitativa em Tempo Real e o 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} Método. Métodos. 2001;25:402-8.
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