Resultados
Imaging cAMP no cílio primário de células vivas usando biossensores fluorescentes apresenta vários desafios únicos. Primeiro, os cílios são pequenos e esbeltos, projetados 2-10 µm acima da superfície da célula; segundo, enquanto não móveis, estão sujeitos a movimento devido ao fluxo volumétrico na solução de banho, e terceiro, sinais ciliares bona fide podem ser difíceis de separar opticamente da fluorescência de fundo que emana do corpo da célula. Apesar de já termos descrito anteriormente (19, 24, 25) vários ciliares alvo de cAMP, procurámos gerar biossensores ratiométricos com maior luminosidade e fidelidade ao alvo. Após testarmos inúmeros desenhos, encontramos a melhor focalização, brilho e sensibilidade oferecidas pelas sondas da quarta geração Epac do laboratório de Kees Jalink (EpacH188 e uma versão com maior afinidade, EpacH187) (26) combinada com Arl13b, uma proteína altamente localizada a cílios (27) (Fig. 1A). Sensores incorporando o receptor 5-HT6 deram uma localização comparativamente boa como sondas acopladas a Arl13b; entretanto, como discutido abaixo, os receptores 5-HT6 não localizados a cílios causaram elevação do AMPc celular devido à conhecida atividade constitutiva deste GPCR (28).
cAMP sinalização em cílios de células permeabilizadas por digitonina. Todos os experimentos foram realizados em tampão intracelular complementado com ATP e GTP. (A) células mIMCD3 expressando 5-HT6-mCherry e Arl13b-H187 localizadas tanto na célula como no cílio não responderam a 10 µM 5-HT no corpo celular ou no cílio após 2 min de tratamento com 20 μg/mL de digitonina (4 experimentos, 5 cílios). (B) Similarmente, a resposta ao agonista inverso, 1 µM SB742457, e subseqüente resposta de 5-HT6 de rebote foram perdidas tanto na célula quanto no cílio após 2 min de tratamento com 20 μg/mL digitonina (3 experimentos, 3 cílios). (C) A permeabilização da digitonina ablated the 50 µM forskolin-induced cAMP signal in cell bodies, but cAMP increase was detectctable in cilia; 1 mM IBMX-induced PDE inhibition did not unmasked any signal (n = 4 experimentos com 4 cílios/7 células). (D) A cotransfecção AC3 não alterou a resposta do forskolin. (E) Quantificação e comparação da resposta de cAMP a forskolin em corpos celulares e em cílios; **P = 0,0002, ***P = 00019. Traços azuis = corpo celular, traços vermelhos = cílios. Barras de tempo: 3 min. O eixo y é a razão 480/535 nm.
Uma explicação óbvia para a falta de efeito nos experimentos anteriores foi que o AMPc não se acumulou o suficiente para ser capturado pelo repórter. Entretanto, quando o mesmo experimento foi repetido usando forskolin para ativar diretamente ACs endógenas (adenylyl ciclases) presentes na membrana ciliar, um pequeno mas consistente acúmulo de cAMP foi detectado no microambiente do cório mas não no corpo celular (Fig. 4 C e E, gráficos de barras à esquerda). Resultados similares foram obtidos em células que expressam AC3 (36) (Fig. 4 D e E, gráficos de barras à direita), que foi localizado para cílios quando expresso em células mIMCD3 (Apêndice SI, Fig. S8). Assumindo que a permeabilização não levou à perda de componentes essenciais das máquinas de sinalização GPCR, a pequena mas detectável mudança após a adição de forskolin sugere que deveria ter sido possível resolver os sinais de cAMP dependentes de GPCR se estes tivessem ocorrido no cilo. Estes dados também indicam que a membrana ciliar das células mIMCD3 foi deixada intacta após o tratamento com digitonina.
Os dados anteriores nos deixam com a questão de por que os GPCRs não são competentes para produzir AMPc uma vez seqüestrados no cilo. Estudos anteriores citaram a entrada de Ca2+ através da membrana ciliar como um importante regulador do AMPc organela devido à presença de canais condutores de Ca2+ específicos para cílios (PKD2L1 e PKD2) e ACs reguladas para Ca2+ (AC1, 8, 5 e 6) (11, 16, 23, 32, 37). Cílios primários de células mIMCD3 têm sido relatados para abrigar AC5 e/ou AC6 inibíveis com Ca2+ (10). Portanto, consideramos que o alto repouso e a permeabilidade de Ca2+ do cório (38, 39) poderiam ser responsáveis pela inativação das ACs acopladas ao receptor 5-HT6. Para melhor abordar este ponto, melhoramos o sensor substituindo a sequência de alvo Arl13b por um receptor 5-HT6 funcional para direcionar a fusão cAMP reporter-GPCR diretamente para o cilo (5-HT6-EpacH187). Consistente com os dados das Figs. 3I e 4C, quando direcionado exclusivamente ao cilo, o 5-HT não produziu um sinal cAMP mensurável (Fig. 5A). A exposição das células a soluções nominalmente livres de Ca2+ não resgatou a resposta de 5-HT em cílios (Fig. 5B), indicando que a entrada de Ca2+ através da membrana ciliar não suprimiu o sinal. Consideramos que talvez a expressão do 5-HT6 tenha alterado a distribuição ciliar da proteína Gαs em células mIMCD3, mas experimentos imunológicos sugeriram que este não é o caso (Apêndice SI, Fig. S9). Entretanto, quando testamos o efeito da 5-HT em células pré-tratadas com SAG (250 nM a 1 µM) para ativar os receptores Smo (40), fomos capazes de restaurar a responsividade do receptor 5-HT6 ao agonista (Fig. 5C). A sensibilidade ao agonista inverso também foi aparente, implicando na restauração da atividade constitutiva (Fig. 5D).
Ativação da via de ativação do porco-espinho aumenta a resposta de cAMP relatada pelo 5-HT6-Epac-H187 para 5-HT e dopamina em cílios primários: (A) Consistentes com os dados das Figs. 3I e 4C, células mIMCD3 não responderam a 10 µM 5-HT quando a fusão sensor/receptor foi confinada estritamente à membrana ciliar (6 experimentos, 6 cílios). (B) Atenuando a alta em cílios, colocando as células em uma solução nominalmente livre de Ca2+ não resgatou a sinalização cAMP estimulada por 5-HT (5 experimentos, 6 cílios). (C) Após pré-tratamento noturno com 1 µM de SAG, 5 dos 6 cílios (6 experimentos) responderam à estimulação de 5-HT (**P = 0.000992). (D) Pré-tratamento com 1 µM SAG resgatou a resposta a 1 µM SB742257 (-35,5 ± 11,2% abaixo da linha de base em relação ao aumento subseqüente de cAMP, provocado por 10 µM 5-HT; típico de 4 experimentos, 4 cílios). (E) Um aumento de cAMP em cílios NIH 3T3 (típico de 9 experimentos, 11 cílios) foi causado por 10 μM 5-HT. (F) O pré-tratamento noturno com 1 μM SAG aumentou significativamente a resposta de 5-HT (**P = 0,00034; 6 experimentos, 7 cílios). O pré-tratamento noturno com 10 μM ciclopamina (Cyclo) teve um efeito insignificante (8 experimentos, 9 cílios, gráfico de barras). (G e H) A somatostatina 100 nM (SST) atenuou a resposta de 5-HT em cílios abrigando SSTR3-GFP com e sem pré-tratamento SAG (G: 5 experimentos, 6 cílios; H: 2 experimentos, 5 cílios). (I e J) O pré-tratamento com SAG aumentou a resposta de 10 nM dopamina (DA) (I: 4 experimentos, 4 cílios, J: 4 experimentos, 6 cílios, **P = 0,002476). Traços azuis, corpo celular; traços vermelhos, cílios. Barras de tempo: 3 min. O eixo y é a relação FRET 480/535 nm. Os gráficos de barras indicam a resposta 5-HT ou DA como uma percentagem da resposta forskolin/IBMX; as barras de erro representam SEM.
Os resultados precedentes deixaram-nos com a questão de saber se a regulação ascendente inesperada dependente de SAG do receptor 5-HT6, expressa em células mIMCD3, era específica do tipo de célula e/ou GPCR. Ao contrário do mIMCD3, a estimulação de células 3T3 (Fig. 5E) e MEFs (Apêndice SI, Fig. S10A) com 5-HT produziu uma alteração mensurável da razão que foi, no entanto, significativamente melhorada após o tratamento com SAG (Fig. 5F e Apêndice SI, Fig. S10B). Curiosamente, a ciclopamina antagonista do receptor suavizado, que poderia ter o efeito oposto do SAG, não aboliu a sinalização de AMPc 5-HT estimulada em cílios primários de células 3T3 (gráfico de barras, Fig. 5F).
Utilizando este sistema, também fomos capazes de avaliar a capacidade de um ciliar Gαi-coupled GPCR, SSTR3, de reverter sinais de AMPc estimulados por serotonina no cílio. Tratamento de células 3T3 coexpressoras SSTR3-GFP e 5-HT6-H187 com somatostatina invertida de 5-HT de volta à linha de base em 2 min na presença e ausência de tratamento com SAG (Fig. 5 G e H), indicando o controle local da função 5-HT6. Em seguida, testamos ainda como o SAG afetou a atividade de outro ciliar Gαs acoplado ao GPCR, o receptor de dopamina D1R (5). D1R-EGFP foi coexpressa com 5-HT6-H187 em células 3T3, e células com fluorescência apenas em cílios foram selecionadas. Dez nanomolares de dopamina produziram pequenos mas mensuráveis sinais de AMPc em células de controle (Fig. 5I), e novamente, o sinal foi significativamente melhorado após o tratamento com SAG (Fig. 5J; resumido no gráfico de barras).