Resultados e discussão
Conjugation of Spirogyra has been reported to be induced by lowering nitrogen content or depletion (Grote 1977; Yamashita e Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Portanto, primeiro tentamos induzir a conjugação através do esgotamento do nitrogênio do meio de cultura. Entretanto, isso não foi bem sucedido. Grote (1977) relatou que a conjugação foi induzida em meio de cultivo inorgânico puro e que o valor do pH era importante. Apesar de termos incubado os filamentos de algas no meio de vários pH, a conjugação não foi induzida. Além disso, outros ensaios, várias temperaturas e esgotamento de vários nutrientes, não foram bem sucedidos. Foi relatado que a conjugação foi induzida pela incubação dos filamentos de algas sob iluminação contínua em algumas espécies de Spirogyra (Yamashita e Sasaki 1979). No entanto, os nossos materiais não mostraram conjugação, mesmo quando os filamentos foram incubados sem fonte de nitrogénio sob iluminação contínua durante 2 semanas. Após várias tentativas acima, finalmente conseguimos induzir a conjugação incubando filamentos em placa de ágar preparado usando APW a 23°C sob um ciclo L-D de 12:12-h durante 4 dias. O rizóide em forma de haste também foi formado na extremidade distal das células terminais durante a incubação. Quando os filamentos na placa de ágar foram incubados no escuro, o fenômeno de conjugação não foi induzido. Allen (1958) relatou que a conjugação foi induzida pela incubação em placa de ágar. Ela manteve uma cultura de estoque usando o meio terra-água de Pringsheim (Pringsheim 1946) sob um regime de 16 h de luz (tubo fluorescente branco frio)-8 h de escuridão a cerca de 20°C. Para indução de acasalamento, vários filamentos foram transferidos para 1,5% de ágar Difco preparado com água destilada e incubado a cerca de 20°C sob um ciclo L-D de 16:8-h. Após incubação durante alguns dias, formaram-se zigospores em placa de ágar. Embora as condições de luz e temperatura durante a incubação fossem diferentes, o método de Allen (1958) foi fundamentalmente o mesmo para o nosso método. Analisamos ainda os fatores responsáveis pela indução da conjugação na placa de ágar, como segue.
Perguntamo-nos se algum contaminante(s) desconhecido(s) contido(s) no pó de ágar era(eram) responsável(eis) pela indução da conjugação. Examinamos esta possibilidade através do experimento a seguir. O pó de ágar (Wako, Osaka, Japão) foi suspenso em APW e mantido a 4°C sob agitação durante a noite. Após a centrifugação (185×g, 10 min), o grânulo resultante foi lavado 2 vezes com APW por centrifugação. O granulado final de ágar foi suspenso em APW fresco e as placas foram preparadas. A conjugação foi induzida com sucesso nesta placa de ágar. Quando os filamentos de algas foram incubados em sobrenadante obtido por lavagem do pó de ágar, a conjugação não foi induzida de forma alguma (dados não mostrados). Assim, a incubação em placa de ágar mas não contaminante solúvel foi responsável pela indução da conjugação.
Desde que APW não continha produtos químicos azotados, a placa de ágar deve conter nenhum ou muito pouco nitrogénio. Portanto, foi possível que ambos os fatores, localização na placa de ágar e esgotamento do nitrogênio, funcionassem sinergicamente na indução. Para examinar esta possibilidade, incubamos filamentos em placa de ágar preparado usando APW suplementado com 1 mM KNO3. Nesta placa de ágar, a conjugação também foi induzida (Fig. 1a), indicando que a depleção de nitrogênio não é responsável pela indução da conjugação. Além disso, a conjugação foi induzida quando os filamentos foram incubados na placa de ágar preparado com meio closterium, que continha vários nutrientes (Fig. 1b). Estes resultados indicam inequivocamente que a localização na placa de ágar em si é um fator responsável pela indução da conjugação.
Efeito do KNO3 e do meio closterium no início da conjugação na placa de ágar. Cerca de 100 filamentos foram incubados em placas de ágar preparado usando APW, APW suplementado com 1 mM de KNO3 ou meio closterium a 23°C sob um ciclo L-D de 12:12 h durante 4 dias. Quando a papila foi observada, julgamos que a célula iniciou a conjugação. Os resultados foram apresentados como uma relação entre os filamentos iniciaram a formação do tubo de conjugação e o número total de filamentos. Os experimentos foram repetidos 3 vezes e os dados foram representados como média e erro padrão da média (SEM)
Indução de conjugação em placa de ágar foi examinada em outras espécies, S.fuluviatilis, que diferenciou rizóide ao cortar os filamentos de algas (dados não mostrados) como no caso de S. castanacea. Nesta espécie, a conjugação também foi induzida na incubação em placa de ágar preparada com APW. Examinámos ainda a conjugação em placa de ágar em três Spirogyra, que não diferenciava o rizóide. S.ellipsospora Transeau foi mantida em laboratório como contaminante do cultivo de Chara. Outras duas Spirogyra sp. coletadas do Lago Biwa foram mantidas como cultura axênica por 6 meses. As três Spirogyra não mostraram conjugação por incubação em placa de ágar.
Em algumas espécies de Spirogyra, a conjugação foi induzida por redução ou esgotamento do conteúdo de nitrogênio (Grote 1977; Yamashita e Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Além do teor de nitrogênio, a intensidade luminosa e/ou o pH tiveram que ser controlados em S. majuscule (Grote 1977). Em S. castanacea e S.fuluviatilis, a incubação na placa de ágar foi eficaz e não foi necessário o esgotamento do nitrogênio (presente estudo). Por outro lado, Agrawal e Singh (2002) relataram que Spirogyra sp. não iniciou a conjugação em 2-10% da placa de ágar. Isto foi semelhante aos nossos resultados obtidos em Spirogyra sp., que não diferenciava o rizóide. Assim, os fatores necessários para a indução da conjugação são muito variáveis entre as espécies de Spirogyra. Nós nos perguntamos se a inibição do crescimento foi responsável pela indução da conjugação na placa de ágar. Durante a incubação em placa de ágar preparada com APW ou closterium, as células proliferaram através da divisão celular em ambas as placas de ágar quando as células não iniciaram a formação da papila do tubo de conjugação. Assim, a inibição do crescimento não foi o gatilho da conjugação.
Para examinar a presença do tipo de acasalamento entre filamentos, a cultura monoclonal de S. castanacea foi submetida à indução da conjugação. Após 48 h de incubação, dois tipos de conjugação foram encontrados no mesmo filamento (Fig. 2a-c). A Figura 2b mostra células induzidas por conjugação escalariforme (ponta de seta na Fig. 2a). Por outro lado, a Figura 2c mostra a conjugação lateral das células induzidas (seta na Fig. 2a). Os zigospórios foram normalmente formados após a conjugação lateral (Fig. 2d). Yamagishi (1977) relatou que a conjugação escalariforme é geralmente observada, enquanto a lateral foi raramente em S.castanacea. Nosso resultado foi consistente com o de Yamagishi (1977). Entretanto, dentro de um limite de nosso conhecimento, a indução da conjugação escalariforme e lateral em um mesmo filamento (Fig. 2a) é o primeiro relato. Quando dois filamentos se parearam, todas as células de um filamento se comportaram como masculinas e as de outro filamento como femininas na maioria dos casos. Muito raramente, no entanto, os zigospores foram formados em ambos os filamentos (Fig. 3). Assim, o tipo de acasalamento não é fixado pelo menos em S.castanacea. O hipnozigotos foi formado por incubação na placa de ágar durante cerca de 1 mês. No entanto, foi difícil reproduzir a germinação pela adição de meio closterium. O método para reproduzir a germinação deve ser encontrado.
Indução de conjugações escalariformes e laterais no mesmo filamento. a Tanto conjugações escalariformes como laterais foram formadas no mesmo filamento após 48 h de incubação. b Maior ampliação das células mostrando conjugação escalariforme em a (seta). c Maior ampliação das células mostrando conjugação lateral em a (seta). d Zigospores formados via conjugação lateral após 96 h de incubação. Bars 50 μm
Conjugação em cultura de clones. Após 96 h de incubação em placa de ágar, formaram-se zigotos. Zigospores foram formados em ambos os filamentos. Barra 50 μm
Examinamos a identificação de materiais extracelulares secretados durante o processo de acasalamento usando várias lectinas em S. castanacea. Entre 19 lectinas examinadas (BSL-I, BSL-II, Con A, DBA, DSL, ECL, jacalin, LEL, PHA-E, PHA-L, PNA, PSA, RCA I, SBA, SJA, STL, UEA I, VVL e WGA), BSL-1, Con A, jacalin, RCA-I e SBA coraram células reprodutivas mas não células vegetativas (Tabela 1). Yoon et al. (2009) relataram que três lectins, Con A, RCA e UEA, mostraram rotulagem considerável em materiais extracelulares em S. varians (Hassall) Kützing. Assim, os materiais aglutinantes de lectina secretados durante a conjugação parecem, em certa medida, diferentes entre as espécies. Relatamos anteriormente que a BSL-I e a jacalina apresentaram padrões de coloração contrastantes em rizóide: a jacalina corou claramente o contorno do rizóide, enquanto a coloração com BSL-I foi difusa (Inoue et al. 1999, Ikegaya et al. 2008b). Foi sugerido que o material de ligação com BSL-I era responsável pela adesão dos filamentos ao substrato. Por outro lado, especulou-se que o material de ligação à jacalina estaria envolvido no reconhecimento do substrato (Ikegaya et al. 2008b). No presente estudo, portanto, concentramos nossa atenção na BSL-I e na jacalina (Fig. 4). Após 48 h de incubação em placa de ágar, um filamento mostrado na Fig. 4a formou papilas em várias direções. Especulou-se que este filamento iniciou a formação de papilas na ausência do filamento parceiro. BSL-I superfície fortemente corada de papilas. Septa entre as células também foram fortemente coradas. A seguir, coramos um par de filamentos que começou a conjugação após 48 h de incubação. Na Fig. 4b, foi julgado que o filamento superior era gameta masculino e que o inferior era gameta feminino, respectivamente, uma vez que o diâmetro das células inferiores do filamento torna-se maior do que o do filamento superior. Tubos de conjugação alongados de células pareadas foram fortemente corados, enquanto toda a superfície celular do gameta feminino foi fracamente corada (Fig. 4b′). Após 72 h de incubação, toda a superfície celular do gameta masculino também foi fracamente corada (Fig. 4c′). Após 96 h de incubação em placa de ágar, foram formados zigospores (Fig. 4d). Os tubos de conjugação foram fortemente corados (Fig. 4d′), enquanto a superfície dos zigospórios não foi corada. Em seguida, a coloração com jacalina foi examinada. Células de filamentos na Fig. 3e formaram papilas na mesma direção. Especulamos que este filamento começou a conjugação na presença de um filamento parceiro e se perdeu durante a transferência para o vidro da lâmina. As papilas foram fortemente coradas com jacalina (Fig. 4e′). Ao longo do processo de conjugação, a jacalina corou principalmente os canais da conjugação (Fig. 4f′-h′). O padrão de coloração com Con A, RCA-I e SBA também foi examinado (dados não mostrados). Con A corou fortemente o septo entre os zigospore formados na gameta fêmea, enquanto as papilas eram muito fracas. Quando os zigosporos se formaram, o padrão de coloração com RCA-I ou SBA foi semelhante ao da BSL-I, como mostrado na Fig. 4d′.
Tabela 1
Enquadramento de várias lectinas para ligação a células vegetativas e reprodutivas de Spirogyracastanacea
| Lectinas | Células vegetativas | Células redutoras | Especificidade |
|---|---|---|---|
| BSL-I | × | ○ | Gal α, GalNAc α |
| Con A | × | ○ | Man α, Glc α |
| Jacalin | × | ○ | Sialyl-Gal β1-3 GalNAc-O- |
| RCA I | × | ○ | >Gal, GalNAc |
| SBA | × | ○ | GalNAc |
| WGA | × | × | >(GlcNAc)n, ácido siálico |
Células foram coradas (○), não coradas de todo (×)
Coloração de filamentos no processo de reprodução sexual com BSL-I e jacalina. Os filamentos incubados em placa de ágar foram corados com BSL-I ou jacalina marcados com fluoresceína (a′-h′). Microfotografias de campo brilhante também são mostradas (a-h). a′-d′ coloração com BSL-I. Após 48 h de incubação no ágar, formaram-se papilas em várias direcções (a, a′), ou iniciou-se a conjugação de filamentos (b, b′). Os filamentos conjugados após 72 h de incubação (c, c′). Após 96 h de incubação, formaram-se zigotos (d, d′). e′-h′ coloração com jacalina. Após 48 h de incubação no ágar, formaram-se papilas no mesmo sentido (e, e′), ou iniciou-se a conjugação de filamentos (f, f′). Os filamentos conjugados após 72 h de incubação (g, g′). Após 96 h de incubação, formaram-se zigotos (d, d′). Barra 50 μm
Examinamos o efeito de seis lectins, BSL-I, Con A, jacalin, RCA-I, SBA, e WGA, sobre a conjugação. Os filamentos foram pré-incubados em APW suplementados com um dos lectins durante 1 dia. Em seguida, foram transferidos em placa de ágar suplementada com a mesma lectina e incubados por 4 dias. Verificou-se que a jacalina inibiu severamente a formação de zigospore, mas outros não (dados não mostrados). A análise sistemática mostrou que a jacalina inibiu severamente a etapa do início; início da formação da papila (Fig. 5). Em seguida, foi examinada a reversibilidade da inibição pela jacalina. Filamentos foram incubados sucessivamente em APW suplementados com jacalina durante 1 dia e depois em APW sem jacalina durante 1 dia. Em seguida, foram incubados em placa de ágar sem jacalina por 4 dias. No entanto, não se formou papila de todo. Esta inibição irreversível pode ser causada por uma forte ligação de jacalina. Yoon et al. (2009) relataram que a RCA e a UEA inibiram a conjugação. Entretanto, eles não identificaram o passo da inibição. Embora BSL-I, RCA-I, Con A e SBA também corassem o tubo de conjugação, eles não inibiram a formação da mesma. Os papéis dos materiais reconhecidos pela BSL-I, RCA-I ou SBA são alvo de estudos futuros.
Efeito das lectinas no início da formação do tubo de conjugação. Cerca de 100 filamentos foram incubados em APW suplementados com 1 μg/ml BSL-I, Con A, jacalin, RCA-I, SBA ou WGA a 23°C sob um ciclo L-D de 12:12 h durante 1 dia, e depois foram transferidos em placa de ágar suplementada com a mesma lectina e incubados durante 4 dias. Quando a papila foi observada, julgamos que a célula iniciou a conjugação. Os resultados foram representados como uma relação entre os filamentos iniciaram a formação do tubo de conjugação e o número total de filamentos. As experiências foram repetidas 4 vezes e os dados foram representados como a média e SEM
Randhawa (1959) sugeriu similaridade dos processos de conjugação e formação de rizóides: o estímulo de contato está envolvido. Por outro lado, Kniep (1928) acreditava que os processos de conjugação eram essencialmente devidos a um estímulo químico (citado em Randhawa (1959)). Tanto o tubo de conjugação como o rizóide começam através da formação de papila e podem alongar-se através do crescimento da ponta. No entanto, o tubo de conjugação é formado no flanco, mas o rizóide é formado na extremidade distal da célula (Nagata 1973). Jacalin manchou claramente o contorno tanto do tubo conjugado (Fig. 3e′-h′) quanto do rizóide (Ikegaya et al. 2008b). Jacalin não inibiu a formação de rizóide, mas inibiu a diferenciação para ser rizóide em forma de roseta (Ikegaya et al. 2008b). No caso de tubos conjugados, entretanto, a jacalina inibiu a formação de papila per se (Fig. 5). Parece que o papel do material ligante da jacalina é diferente em tubo de conjugação e rizóide.
Sucesso na indução reprodutível da conjugação em laboratório abriu caminho para análises sistemáticas da conjugação em Spirogyra, tais como mecanismo de determinação da sexualidade das células, papel do material ligante da lectina, mecanismo de movimento do protoplástico masculino.