Abstract
Mecanismele de acetilare a mai multor substraturi tipice selectate din experimente, inclusiv arilamine și arilhidrazine, sunt investigate cu ajutorul teoriei funcționale a densității în această lucrare. Rezultatele indică faptul că toate stările de tranziție sunt caracterizate de o structură inelară cu patru membri, iar hidralazina (HDZ) este cel mai puternic substrat. Bioactivitatea pentru toți compușii este crescută într-o secvență de PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ. Efectul de conjuncție și delocalizarea perechilor singuratice ale atomului de N joacă un rol esențial în reacție. Toate rezultatele sunt în concordanță cu datele experimentale.
1. Introducere
Arilamina N-acetiltransferazele (NATs, EC 2.3.1.5) sunt enzime ale metabolismului de fază II întâlnite atât la procariote cât și la eucariote . Reacția de N-acetilare conduce la detoxifierea xenobioticelor de tip arilamină și, în cele din urmă, se îndreaptă către ionii electrofilici de arilnitreniu, care sunt considerați a fi responsabili de formarea adaosurilor la ADN . Până la oameni, cele două izozime NAT funcționale, NAT1 și NAT2, prezintă mari diferențe în ceea ce privește specificitatea substratului și distribuția tisulară, în ciuda unei identități de secvență de aminoacizi de 81% . Cea din urmă, NAT2, este exprimată predominant în ficat și în epiteliul intestinal . Studiile anterioare au presupus că NAT-urile catalizează un transfer de acetil printr-un mecanism cinetic clasic de tip ping-pong (schema 1). Analiza prin mutageneză dirijată la fața locului a NAT2 uman și a NAT din Salmonella typhimurium (StNAT) a sugerat că un reziduu de cisteină din situsul activ este responsabil pentru medierea procesului de acetilare. Un studiu recent al cineticii în stare pre-staționară și staționară asupra acetatului de p-nitrofenil (PNPA) și NAT2 a arătat că mecanismul catalitic al NAT2 ar putea depinde de formarea unei perechi tiolat-imidazoliu. Deși enzima se găsește atât la eucariote, cât și la procariote, rolurile endogene ale NAT-urilor sunt încă neclare. Determinarea substratului a arătat că atât arilaminele, cât și arilhidrazinele pot fi acetilate de NATs . Etapele necesare în reacția de transfer de acetil sunt compuse din transferul grupului acetil de la reziduul de cisteină din situsul activ la substrat și eliminarea unui proton de la acesta din urmă la cel dintâi. În această lucrare, este disponibil un studiu teoretic detaliat asupra comportamentelor substraturilor arilamine și arilhidrazine în acetilare, incluzând proprietățile structurilor acestora, stările de tranziție, profilurile energiilor.
Reacția de transfer de acetil catalizată de NATs.
2. Metodologii
Toate calculele au fost efectuate cu metoda B3LYP a teoriei funcționale a densității (DFT), așa cum este implementată în pachetul de programe Gaussian03 , care a fost utilizată anterior cu succes pe o serie de sisteme enzimatice . Atunci când au fost utilizate seturile de baze 6-31G* și 6-311+G (3df, 2p), funcționalitatea hibridă B3LYP a fost preferată față de metodele Hartree-Fock (HF) și MP2 . Deși uneori nu reușește să trateze interacțiunile bogate în dispersie, metoda B3LYP a fost aplicată cu succes la multe sisteme biologice .
Geometriile tuturor reactanților, intermediarilor și produselor sunt optimizate la nivelul de teorie B3LYP/6-31G*. Au fost calculate cele mai stabile conformații, precum și energiile acestora la fiecare echilibru și stări de tranziție. Se efectuează calcule de frecvență pentru toate punctele staționare rezultate, iar fiecare stare de tranziție are o singură frecvență imaginară. În plus, metoda MP2/6-311+G** este utilizată pentru structurile optimizate ale punctelor staționare pentru a obține profile energetice mai precise. În cazul în care nu se precizează în mod special, toate analizele energetice de mai jos se referă la rezultatele calculelor MP2/6-311+G**//B3LYP/6-31G (d).
3. Rezultate și discuții
3.1. Obictele de frontieră ale substraturilor
Sase substraturi, acid p-aminobenzoic(PABA), 4-metoxilanilină(4-MA), 4-aminosalicilat (4-AS), 5-aminosalicilat(5-AS), izoniazidă(INZ), hidralazină (HDZ), sunt selectate conform referințelor , care pot fi împărțite în două familii distincte: arilamine și arilhidrazine. În tabelul 1 sunt enumerate energiile pentru obicetele de frontieră (inclusiv HOMO-2, HOMO-1, HOMO, LUMO, LUMO+1 și LUMO+2) ale tuturor celor șase substraturi, care sunt considerate a juca roluri importante în sistemele bioenzimatice . În cazul arilaminelor, energiile HOMO sunt reduse într-o secvență de 4-MA > 5-AS > PABA > 4-AS, ceea ce indică creșterea reactivității lor nucleofile. Dintre toate cele șase substraturi (a se vedea figura 1 din materialele suplimentare disponibile online la doi: 10.1155/2009/783035), INZ are cel mai mare decalaj energetic între HOMO și LUMO, ceea ce sugerează stabilitatea sa. Rezultatele analizei populației naturale (Natural Population Analysis – NPA) au arătat că atomii activi de amino N pentru familia arilaminelor sunt mai electronegativi decât cei din grupul hidrazinelor, ceea ce este cauzat în principal de efectul de conjugare.
Chiar dacă PABA și 4-AS au substituții diferite pe situsul p al grupării amino la nivelul inelului cu șase membri, bioactivitățile lor sunt aproape identice. O legătură H intermoleculară va stabiliza substratul însuși, cu o scădere de energie de aproximativ 19-21 kJ/mol. Atât energiile HOMO, cât și LOMO pentru 5-AS sunt mai mari decât cele ale 4-A𝑆s, sugerând că primul este mai reactiv decât cel de-al doilea.
Pentru substraturile de arilhidrazine, perechea singuratică a atomilor de N de la coloana vertebrală a inelului cu șase membri va fi delocalizată la nivelul întregului sistem, astfel încât să crească stabilitatea acestuia. Valorile 𝐸(𝐿-𝐻)ale HDZ sunt cu 0,0318 u.a. mai mari decât cele ale INZ, ceea ce indică o reactivitate mai mare decât a acesteia din urmă.
3.2. Diferitele căi și stări de tranziție
În principiu, toate substraturile pot reacționa cu reziduul de cisteină din situsul activ prin intermediul unei căi concertate sau a uneia etapizate. Pentru prima, stările de tranziție (a se vedea figurile 1 și 2, con- tinuă) cunosc un transfer concertat al hidrogenului H5 la atomul S1 al cisteinei și o formare de legături între atomii N4 și C2. Ruperea vechilor legături (N4H5 și S1C2) și formarea altora noi (C2N4 și S1H5) au loc simultan. Reactanții și produșii țintă sunt conectați prin singura stare de tranziție de pe suprafața de energie potențială (PES). Datele structurii principale ale tuturor stărilor de tranziție sunt enumerate în tabelul 1 din materialele suplimentare. Pentru mecanismul etapizat, atomul H5 va fi transferat mai întâi la atomul O3 al grupului carbonil, tinzând să genereze o nouă legătură între N4 și atomul C2 prin intermediul stării de tranziție stw-ts1. Apoi, se va forma un intermediar tiolester (intmed). În consecință, va avea loc a doua migrare a lui H5 de la gruparea hidroxil la atomul S1 prin stw-ts2, împreună cu ruperea legăturii S1-C2, ceea ce va conduce în final la produși.
Cursele concertate și etapizate pentru reacția catalizată de arilamină N-acetiltransferazele arilaminei.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Structura stărilor de tranziție atât pentru calea concertată, cât și pentru cea etapizată a PABA.
Rezultatele indică faptul că toate stările de tranziție sunt caracterizate de o structură inelară cu patru membri care este aproape plană. Există două unghiuri mici, mai mici de 80°, în fiecare stare de tranziție (C2S1H5 și S1C2N4 pentru con-ts, C2O3H5 și C2N4H5 pentru stp-ts1, C2S1H5 și S1C2O3 pentru stp-ts2), care aduc o mare tensiune la nivelul întregului sistem și îl fac instabil. Dintre cele șase stări de tranziție concertate (con-ts) ale tuturor substraturilor, proprietățile legăturii C2N4, N4H5 și S1H5 sunt aproximativ aceleași pentru toate substraturile, în timp ce interacțiunea dintre S1 și C2 este unul dintre factorii determinanți pentru etapa concertată.
Lucrurile devin diferite pentru căile etapizate. Modificările de hibridizare a atomului C2 urmează o tendință similară (𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3) pentru toate substraturile în timpul acetilării etapizate (tabelul 1 suplimentar). Prima migrare a H5 va conduce la starea de tranziție stp-ts1, iar apoi un intermediar numit intmed este localizat pe suprafața de energie potențială (PES), care este un minim local. Acesta este un intermediar tiolester tetraedric, așa cum a fost propus în studiile experimentale anterioare . Acesta este de scurtă durată și un transfer H5 consecvent va avea loc în curând prin intermediul stării de tranziție stp-ts2. Pentru calea etapizată, structurile stărilor de tracțiune pentru diferite substraturi diferă foarte puțin de altele. Structurile 3D ale stărilor de tranziție au fost listate pentru PABA (figura 2), celelalte fiind similare cu acestea.
3.3. Energiile
Energiile relative ale tuturor căilor posibile pentru cele șase substraturi sunt realizate pe baza sumei energetice a reactanților luate ca fiind zero (figura 3). Din figura 3, se constată că căile concertate sunt favorizate față de cele etapizate. Barierele energetice ale stărilor de tranziție concertate (con-ts) sunt mai mici decât cele ale stărilor de tranziție pas cu pas (stp-ts1) într-un interval cuprins între 83,5 kJ/mol și 26,9 kJ/mol (tabelul 2 suplimentar). Arilhidrazinele sunt substraturi mai bune decât arilaminele, iar HDZ este cel mai reactiv, cu cea mai mică energie de activare, ceea ce corespunde datelor experimentale cu o bună concordanță . Această concluzie a putut fi trasă și din analiza datelor de structură (tabelul 1 suplimentar). Efectul de conjuncție sporit și delocalizarea perechilor singulare de azot la nivelul coloanei vertebrale au stabilizat starea de tranziție. Bioactivitatea pentru toate substraturile este crescută într-o secvență de PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ.
Profilele energetice pentru toate substraturile.
4. Concluzii
Se pot trage următoarele concluzii.
(i)Toate substraturile pot fi acetilate prin două căi diferite: cea concertată și cea etapizată, iar prima este mult preferată datorită energiilor de activare mai mici.(ii)Din calculele noastre, arilhidrazinele sunt substraturi mai bune decât arilaminele, iar HDZ este cel mai reactiv și are cea mai mică energie de activare. Bioactivitatea pentru toate substraturile este crescută într-o secvență ca PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ, care este în concordanță cu rezultatele experimentale foarte bine . (iii)Efectul de conjuncție și perechile lone delocalizate joacă roluri foarte importante în acetilare. Efectul de conjuncție sporit și creșterea numărului de perechi singuratice la nivelul inelului cu șase membri vor duce la scăderea barierei energetice.
Recunoștințe
Această lucrare a fost susținută de Fundația Națională Științifică Naturală a Chinei (nr.20603030, nr.20873074, și nr.10674114), proiectul 973 al Ministerului Științei și Tehnologiei din China (nr. 2009CB930103), Fundația Științifică Naturală a Provinciei Shandong (nr. Q2008B07) și Fundația pentru Grupuri de Cercetare Creativă a Universității Ludong (nr. 08-CXA001).
Materiale suplimentare
Pentru limitarea lungimii acestei lucrări, structurile 3D ale tuturor arilaminelor, și ale substraturilor arilhidrazinelor, datele structurii principale pentru toate stările de tranziție și energiile relative pentru diferite căi au fost adunate în materialele suplimentare.
- Materiale suplimentare