Free Press

Abstract

Acetyleringsmekanismerna för flera utvalda typiska substrat från experiment, inklusive arylaminer och arylhydraziner, undersöks med täthetsfunktionell teori i denna artikel. Resultaten visar att alla övergångstillstånd kännetecknas av en fyrledad ringstruktur, och hydralazin (HDZ) är det mest potenta substratet. Bioaktiviteten för alla föreningar ökar i en sekvens av PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ. Konjunktionseffekten och delokaliseringen av N-atomens ensamstående par spelar en nyckelroll i reaktionen. Alla resultat överensstämmer med de experimentella uppgifterna.

1. Introduktion

Arylamin-N-acetyltransferaserna (NATs, EC 2.3.1.5) är fas II-metabolismenzymer som finns i både prokaryoter och eukaryoter . N-acetyleringsreaktionen leder till avgiftning av arylamin xenobiotika och leder slutligen till elektrofila arylnitreniumjoner, som anses vara ansvariga för DNA-adduktbildning . De två funktionella NAT-isoenzymerna NAT1 och NAT2 uppvisar stora skillnader i substratspecificitet och vävnadsdistribution trots att de har 81 % aminosyrasekvensidentitet . Den senare, NAT2, uttrycks främst i lever och tarmepitel . I tidigare studier har man antagit att NAT katalyserar en acetylöverföring genom en klassisk ping-pong-kinetisk mekanism (schema 1). En platsriktad mutagenanalys av human NAT2 och Salmonella typhimurium NAT (StNAT) tydde på att en cysteinrest i den aktiva platsen var ansvarig för att förmedla acetyleringsprocessen. Nyligen genomfördes kinetiska studier av p-nitrofenylacetat (PNPA) och NAT2 i presteady-state- och steady-state-kinetik som visade att NAT2:s katalytiska mekanism kan vara beroende av bildandet av ett tiolat-imidazoliumpar. Även om enzymet finns i både eukaryoter och prokaryoter är NATs endogena roll fortfarande oklar. Substratbestämningen visade att både arylaminer och arylhydraziner kan acetyleras av NATs . De nödvändiga stegen i acetylöverföringsreaktionen består av överföringen av acetylgruppen från cysteinresterna på den aktiva platsen till substratet och avlägsnandet av en proton från den sistnämnda till den förstnämnda. I detta dokument finns en detaljerad teoretisk studie av arylamin- och arylhydrazin-substratens beteende vid acetylering, inklusive egenskaperna hos deras strukturer, övergångstillstånd och energiprofiler.

2. Metodik

Alla beräkningar utfördes med B3LYP-metoden för täthetsfunktionsteori (DFT) som implementerats i programpaketet Gaussian03 , som tidigare framgångsrikt har använts på ett antal enzymatiska system . När 6-31G* och 6-311+G (3df, 2p) basuppsättningar användes föredrogs B3LYP-hybridfunktionen framför Hartree-Fock (HF) och MP2-metoder . B3LYP-metoden har framgångsrikt tillämpats på många biologiska system, även om den ibland misslyckas när det gäller att behandla dispersionsrika interaktioner.

Geometrierna för alla reaktanter, intermediärer och produkter optimeras på B3LYP/6-31G* teorinivå. De mest stabila konformationerna samt deras energier vid varje ekvilibrering och övergångstillstånd har räknats ut. Frekvensberäkningar utförs för alla resulterande stationära punkter och varje övergångstillstånd har endast en imaginär frekvens. Dessutom används MP2/6-311+G**-metoden på de optimerade strukturerna av stationära punkter för att få mer exakta energiprofiler. Om det inte särskilt påpekas hänvisar alla följande energianalyser till resultaten från MP2/6-311+G**//B3LYP/6-31G (d)-beräkningar.

3. Resultat och diskussion

3.1. Substratens gränsobitaler

Sex substrat, p-aminobensoesyra(PABA), 4-metoxylanilin(4-MA), 4-aminosalicylat (4-AS), 5-aminosalicylat(5-AS), isoniazid(INZ), hydralazin (HDZ), väljs ut enligt referenserna , som kan delas in i två olika familjer: arylaminer och arylhydraziner. Energierna för gränsobitaler (inklusive HOMO-2, HOMO-1, HOMO, LUMO, LUMO+1 och LUMO+2) för alla sex substrat anges i tabell 1, vilka anses spela viktiga roller i bioenzymatiska system . För arylaminerna minskar HOMO-energierna i en sekvens av 4-MA > 5-AS > PABA > 4-AS, vilket tyder på att deras nukleofila reaktivitet ökar. Bland alla sex substrat (se figur 1 i tilläggsmaterialet som finns online på doi: 10.1155/2009/783035) har INZ det största energigapet mellan HOMO och LUMO, vilket tyder på dess stabilitet. Resultaten från Natural Population Analysis (NPA) visade att de aktiva amino-N-atomerna för arylaminfamiljen är mer elektronegativa än hydrazingruppens, vilket främst beror på konjugationseffekten.

Trots att PABA och 4-AS har olika substitutioner på aminogruppens p-plats vid den sexdelade ringen är deras bioaktivitet nästan densamma. En intermolekylär H-bindning kommer att stabilisera själva substratet med en energiförlust på cirka 19-21 kJ/mol. Både HOMO- och LOMO-energierna för 5-AS är högre än för 4-A𝑆s, vilket tyder på att den förstnämnda är mer reaktiv än den sistnämnda.

För arylhydrazin-substraten kommer det ensamma paret av N-atomerna vid den sexdelade ringens ryggrad att delokaliseras i hela systemet för att öka dess stabilitet. 𝐸(𝐿-𝐻)-värdena för HDZ är 0,0318 a.u. högre än för INZ:s, vilket indikerar dess högre reaktivitet än den senare.

3.2. De olika vägarna och övergångstillstånden

I princip kan alla substrat reagera med cysteinresterna på den aktiva platsen via en samordnad väg eller en stegvis väg. Till den förstnämnda upplever övergångstillstånden (se figurerna 1 och 2, con-ts) en samordnad överföring av väte H5 till S1-atom av cystein och en bindningsbildning mellan N4- och C2-atomerna. Brytningen av gamla bindningar (N4H5 och S1C2) och bildandet av nya (C2N4 och S1H5) sker samtidigt. Reaktanterna och målprodukterna är förbundna med varandra genom det enda övergångstillståndet på den potentiella energiytan (PES). Huvudstrukturdata för alla övergångstillstånd anges i tabell 1 i tilläggsmaterialet. För den stegvisa mekanismen kommer H5-atomen först att överföras till O3-atomen i karbonylgruppen, vilket tenderar att generera en ny bindning mellan N4 och C2-atomen via övergångstillstånd stw-ts1. Därefter bildas en tiolesterintermediär (intmed). Följaktligen kommer den andra migrationen av H5 att äga rum från hydroxylgruppen till S1-atomen via stw-ts2 tillsammans med brytningen av S1-C2-bindningen, vilket slutligen leder till produkterna.

Figur 1

Den samordnade och stegvisa vägen för arylamin N-acetyltransferasernas katalyserade reaktion.

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

Figur 2

Strukturen av övergångstillstånd för både den samordnade och den stegvisa vägen för PABA.

Resultaten visar att alla övergångstillstånd kännetecknas av en fyrledad ringstruktur som är nästan plan. Det finns två små vinklar mindre än 80° i varje övergångstillstånd (C2S1H5 och S1C2N4 för con-ts, C2O3H5 och C2N4H5 för stp-ts1, C2S1H5 och S1C2O3 för stp-ts2), vilket medför stora påfrestningar för hela systemet och gör det instabilt. Bland de sex samordnade övergångstillstånden (con-ts) för alla substrat är egenskaperna hos bindningen C2N4, N4H5 och S1H5 ungefär desamma för alla substrat, medan interaktionen mellan S1 och C2 är en av de avgörande faktorerna för det samordnade steget.

Saker och ting blir annorlunda för de stegvisa vägarna. Hybridiseringsförändringarna av C2-atomen följer en liknande tendens (𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3) för alla substrat under den stegvisa acetyleringen (tabell 1 supplementär). Den första migrationen av H5 leder till övergångstillståndet stp-ts1, och sedan placeras en intermediär som heter intmed på den potentiella energiytan (PES), som är ett lokalt minimum. Det är en tetraedrisk tiolesterintermediär som föreslagits i tidigare experimentella studier . Den är kortlivad och en följdriktig H5-överföring kommer snart att ske via övergångstillstånd stp-ts2. För den stegvisa vägen skiljer sig strukturerna hos övergångstillstånden för olika substrat mycket lite från andra. 3D-strukturerna för övergångstillstånden listades för PABA (figur 2), de andra liknade dem.

3.3. Energierna

De relativa energierna för alla möjliga vägar för de sex substraten utförs utifrån energisumman för reaktanterna som tas som noll (figur 3). Av figur 3 framgår att de samordnade vägarna är gynnade jämfört med de stegvisa. Energibarriärerna för de samordnade övergångstillstånden (con-ts) är lägre än för de stegvisa (stp-ts1) i intervallet 83,5 kJ/mol till 26,9 kJ/mol (tabell 2 i tillägg). Arylhydrazinerna är bättre substrat än arylaminerna, och HDZ är det mest reaktiva med den lägsta aktiveringsenergin, vilket stämmer väl överens med de experimentella uppgifterna. Denna slutsats kan också dras från analysen av strukturdata (tabell 1, tillägg). Den förstärkta konjunktionseffekten och delokaliseringen av kväve-lone paren vid ryggraden stabiliserade övergångstillståndet. Bioaktiviteten för alla substrat ökar i en sekvens av PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ.

Figur 3

Energiprofilerna för alla substrat.

4. Slutsatser

Följande slutsatser kan dras.

(i)Alla substrat kan acetyleras via två olika vägar: den samordnade och den stegvisa, och den förstnämnda är mycket att föredra på grund av de lägre aktiveringsenergierna.(ii)Enligt vår beräkning är arylhydraziner bättre substrat än arylaminerna, och HDZ är det mest reaktiva med den lägsta aktiveringsenergin. Bioaktiviteten för alla substrat ökar i en sekvens som PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ, vilket stämmer mycket väl överens med de experimentella resultaten . (iii)Konjunktionseffekten och de delokaliserade ensamparen spelar mycket viktiga roller vid acetylering. Den förstärkta konjunktionseffekten och det ökande antalet lone par vid den sexdelade ringen leder till en lägre energibarriär.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Natural Scientific Foundation of China (no.20603030, no.20873074 och no.10674114).), 973-projektet från Kinas ministerium för vetenskap och teknik (nr 2009CB930103), Natural Scientific Foundation of Shandong Province (nr Q2008B07) och Foundation for Creative Research Groups of Ludong University (nr 08-CXA001).

Supplementary Materials