Free Press

INDLEDNING

Dyremodeller spiller en vigtig rolle i forbindelse med udvikling af lægemidler og undersøgelser af molekylære biologiske mekanismer. Historisk set var det den kultjæreinducerede hudkræftmodel i kanin, der udløste udviklingen af en kræftinduceret musemodel. Der er blevet etableret forskellige dyremodeller som et evalueringsværktøj til forudsigelse af kræftfremkaldende stoffer og undersøgelse af kræftfremkaldende mekanismer (1). Det er imidlertid tidskrævende og dyrt at anvende kronisk eksponering for et kræftfremkaldende stof, hvilket begrænser dets anvendelse i forbindelse med lægemiddeludvikling. Ikke desto mindre er musemodeller stadig mere attraktive end store dyremodeller på grund af de lave omkostninger, den lette håndtering og den kendte genetiske information (2). For nylig er der blevet udviklet en syngen musemodel, der er injiceret med murine cellelinjer (3). Fordelene ved denne model er reproducerbarhed, mulighed for let at fremkalde forskellige tumortyper og immunokompetence. På den anden side viser denne model ofte et andet respons end resultaterne fra in vitro-forsøg med humane kræftceller. For at overvinde denne ulempe har National Cancer Institute (NCI) anvendt en metode, hvor humane kræftceller injiceres i en immundefekt mus. Der blev udviklet et batteri af xenograftmodeller ud fra otte forskellige NCI-kræftcellelinjer (hjerne, tyktarm, leukæmi, lunge, melanom, æggestokke, prostata og nyre). Desuden er der blevet etableret forskellige metoder til generering af musemodeller til vurdering af nye lægemidlers effektivitet og toksicitet. En model er den genetisk manipulerede musemodel (GEMM), som er en avanceret metode til evaluering af kræftfremkaldende mekanismer og lægemiddelresistens (4). Der anvendes immunkompetente mus til GEMM-modellen i lighed med en syngenisk model. Så denne model gør det muligt at anvende udvikling af immune adjuvante midler mod kræft. Desuden er denne model nyttig til belysning af biologiske processer og til undersøgelse af tumorceller og deres mikromiljø, men den er meget dyr, heterogen og kompliceret. Desuden er tumorfrekvens, udvikling og vækst ikke sammenfaldende i GEMM-modellen (4-7). Mange forskere har udtænkt en strategi for præklinisk evaluering for at bestemme det terapeutiske potentiale og efterligne det menneskelige tumormiljø. Ud over GEMM-modellen anvendes der i in vivo xenograftmodeller athymiske nøgenmus og SCID-mus (severe combined immune deficiency) til implantation af humane kræftceller eller patienttumorvæv i translationel forskning med henblik på kliniske forsøg (8,9). I denne gennemgang fokuseres der på typerne af og karakteristika ved xenograftmodeller for tumorer med henblik på anvendelse til udvikling af lægemidler mod kræft.

Ektopisk xenograftmodel for tumorer. Generelt injiceres humane kræftceller subkutant i bagbenet eller ryggen på mus (fig. 1A). I en ektopisk tumor xenograftmodel (ektopisk model) er det transplanterede sted forskelligt fra oprindelsen af de dyrkede celler. Den ektopiske model er den standardmodel for kræft, der anvendes til validering og vurdering i onkologiske undersøgelser. Efter etableringen af kræftcellelinjer til screening af kræftmidler i NCI blev der udviklet xenograftmodeller, der er afledt af disse cellelinjer. Der blev anvendt 60 cellelinjer fra otte organer til etablering af xenograftmodeller, og der blev rapporteret oplysninger om f.eks. tumorens fordoblingstid og tumorigenicitetsgrad (1). I tabel 1 var den reproducerbare udtagningsrate af xenograftmodellen i humane cancercellelinjer over 90 %. Til evaluering af ledende forbindelser, der er opnået ved en in vitro-screeningstest, viste denne model, at de samme kræftceller kan være nyttige og forudsigelige, hvilket er nyttigt for udvælgelsen af en anvendelig kræftforbindelse til oversættelse til klinisk forsøg.

Da en ektopisk model let kan bruges til at overvåge tumorigenicitet og tumorvækst, har mange forskere anvendt denne model til evaluering af kræftbekæmpelsesvirkning (10-12). Tumorvolumen (V) beregnes ud fra den største længde og den korteste længde af tumoren (ligning1). Ud fra flere parametre baseret på disse data kan den kræfthæmmende aktivitet vurderes. Forholdet mellem den behandlede gruppe (T) og kontrolgruppen (C) (optimal % T/C), tumorvækstforsinkelse og tumorregression blev udnyttet (13-15). Lægemiddelrelaterede dødsfald (DRD) og ændringer i kropsvægt som toksicitetsparametre blev bestemt. DRD var formodet dyredød inden for 15 dage, og over 20 % tab af behandlede muses kropsvægt i forhold til kontrol blev betragtet som en uønsket virkning.

Disse parametre hjælper med at udtrække den ledende forbindelse fra lægemiddel-screening. Lejlighedsvis kunne lægemiddelrespons afhængigt af kræfttyper sammenlignes uden individuelle forskelle, fordi to typer kræftceller kunne transplanteres spontant til den samme mus, og de to tumorer kan vise forskelle i vækst (16). Desuden er den ektopiske model meget reproducerbar, homogen og let at anvende.

Det er imidlertid ikke alle tumorer, der kan anvendes som et vurderingsværktøj, fordi nogle tumorer viser nekrose under tumorigeniciteten, og nogle tumorer er ikke solide (usubstantielle). De immunosupprimerede mus, der anvendes til fremstilling af dyremodeller, repræsenterer et andet mikromiljø end det, der findes ved kræft hos mennesker. Derfor er vurderingen af invasion og metastase begrænset i denne model.

Orthotopisk xenograftmodel for tumorer. Der er blevet udviklet alternative modeller til vurdering af tumorfølsomhed. Den ortotopiske tumor xenograft-model (ortotopisk model) er et avanceret værktøj, men er baseret på et immunosuppressivt murin-mikromiljø. I den ortotopiske model transplanteres de humane kræftceller til det samme sted, som tumoren stammer fra. Lungekræftceller blev f.eks. direkte injiceret i muselungen i forbindelse med den ortotopiske model (fig. 1B). I denne model er det nødvendigt med en veluddannet ekspert med kirurgiske færdigheder for at sikre reproducerbarheden. Det er vanskeligt at beregne tumorigenicitetshastigheden, fordi næsten alle tumorer undtagen melanom er usynlige for det blotte øje. Desuden er ortotopiske modeller begrænset til måling af tumorvækst uden ofre i modsætning til subkutane ektopiske modeller. Indtil nu er billeddannelse den valgte metode til at overvåge udviklingen af voksende tumorer i ortotoper modeller. I øjeblikket observeres ortotoper modeller med kræftcellelinjer, der udtrykker fluorescens eller luciferase, ved hjælp af optisk billeddannelse, computertomografi (CT) eller magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) (17). For at vurdere carcinogenese og bestemme tumorvæksten uden ofre er der behov for dyrt udstyr, så tilgængeligheden af denne model er begrænset. Ikke desto mindre er denne model klinisk relevant for den patientlignende progressionsproces (f.eks. invasion). Ifølge Ho og hans kollegers rapport viser ortotopiske tumorer hurtigere tumorvækst i den tidlige fase, angiogenese og hyperpermeabilitet af blodkar sammenlignet med ektopiske tumorer (18). I nogle kræfttyper blev der også observeret metastase. F.eks. er den ortotoperede model med implantat af tumor i brystfedtpuden også en god model for brystkræft. I denne model ligner spontane tumormetastaser den naturlige udvikling af brystkræft hos mennesker (19). Derfor kan kræftbekæmpende aktivitet og metastasehæmning evalueres i den samme model. Metastasemodellen er beskrevet i detaljer nedenfor.

Metastatisk kræftmodel. Tumorer, der dannes lokalt ved eksponering for ultraviolet, ioniserende stråling og kræftfremkaldende stoffer, cirkulerer i kar og lymfeknuder via invasion og forårsager metastase (sekundær kræft) på steder, der er modtagelige for invasion. Ifølge Paget-hypotesen om frø og jordbund starter den primære kræftcelle (frø) metastase i et egnet miljø (jordbund) som f.eks. lunge, lever, knogler, lymfe og hjerne (20). Nyere forskning har ansporet til udvikling af metastasehæmmere og forebyggende lægemidler baseret på undersøgelser af metastasemekanismerne, men der har ikke været et præklinisk evalueringsværktøj til at definere retningslinjer for godkendelse af et klinisk forsøg.

Til etablering af en metastasemodel er der blevet udviklet forskellige metoder, og der findes to typer humane xenograftmodeller. Ved ortotopisk transplantation giver de transplanterede tumorceller for det første anledning til den primære tumor, tumoren fjernes, og derefter observeres metastase. F.eks. blev WM239-melanomceller transplanteret til SCID-mus (severe combined immune deficiency), og den primære tumor blev isoleret efter 4 uger. Derefter blev der observeret lungemetastase (21). Den ortotopiske model blev fremstillet af prostatakræftceller (DU145), og den fjernede lymfeknude blev dyrket, og isolerede tumorceller blev genindsprøjtet i musene for at opnå en metastasemodel (22). For det andet blev kræftceller intravenøst injiceret i nøgenmus (fig. 1C) eller SCID-mus, hvor de cirkulerede som kræftstamceller og udløste metastase (23). Denne model genereres hurtigere end den førstnævnte model. I hybridmodellen mellem ektopisk og ortotopisk model injiceres fluorescensudtrykkende HT-29-celler (humant tyktarmskræft) subkutant i det ektopiske sted, og flere stykker af HT-29-celleafledte tumorer transplanteres i tyktarmen, hvorefter metastase observeres (24). Generelt er det lettere at opnå en metastasemodel i SCID-mus end i nude-mus. Da metastase, som i den ortotopiske model, er vanskelig at observere i udseende, undtagen i tilfælde af hudkræft (25), blev genetisk manipulerede cellelinjer (fluorescerende (24) eller luciferase-eksprimerende celler (26)) anvendt og overvåget ved hjælp af optisk billeddannelse in vivo. Denne model anvendes ofte til terdiagnostik, som omfatter billeddannelse ved hjælp af MRI eller positronemissionstomografi (PET) (27) for samtidig at diagnosticere og bestemme den passende kræftbehandling. Hidtil er retningslinjerne for anvendelse af metastase som et vurderingsværktøj til lægemiddeludvikling ikke blevet fastlagt. Der er behov for yderligere undersøgelser af reproducerbarhed, mekanismer, der ligger til grund for metastase, og markører.

Patientafledt tumor xenograft-model. Xenograftmodeller er på trods af deres fordele begrænsede i deres evne til at påvise, hvordan en kræftpatient ville reagere på en bestemt behandling. Der er behov for en pålidelig forudsigelse af lægemiddelrespons i et klinisk forsøg, og de nuværende modeller er ikke tilstrækkelige. I et forsøg på at afhjælpe manglerne ved disse modeller blev der udviklet og anvendt en patientafledt tumor xenograft (PDTX) (28,29). Da PDTX indebærer transplantation af kræftpatientvæv direkte til immunsupprimerede mus (Fig. 1D), er genetiske oplysninger og immunohistologiske markører korrelative til patienten og kan anvendes til at evaluere nye kræftmidler (30) og personaliserede kræftterapier. De mange fordele ved PDTX kan sammenfattes som følger: 1

Den PDTX-model har imidlertid tekniske begrænsninger, og den er dyr og tidskrævende. Mest af alt skal frisk udskårne primære humane tumorer leveres fra operationsstuen til laboratoriet inden for flere timer. Samtidig skal en prøve af de primære humane tumorer undersøges ved immunohistologisk analyse. Derfor er det nødvendigt med et samarbejde mellem kirurgen, histologen og forskeren. Derefter kan de oprindelige primære humane tumorer sammenlignes med tumorvæv fra den passerede tumortransplantation. Desuden er det nødvendigt med godkendelse fra et institutionelt review board (IRB), fordi anvendelsen af patientafledt tumorvæv indebærer kliniske og etiske overvejelser. På trods af disse bestræbelser er udnyttelsesgraden af PDTX ca. 25 % (31-33), og det tager ca. tre måneder at etablere PDTX til den første passage (data ikke vist). Som ved xeno-organtransplantation er det nødvendigt med den første transplantation til SCID-mus for at undgå akut immunafstødning, og det er dyrt. Desuden er mængden af patientafledt tumorvæv meget begrænset, så antallet af PDTX-populationer bør øges ved hjælp af passage af tumorvæv, og samtidig bør hver passage af tumorvæv analyseres histopatologisk og sammenlignes med det oprindelige væv. Fra den anden passage kan der anvendes nøgenmus. Stykkerne af tumorvæv kan fryses og opbevares i flydende nitrogen.

Trods disse forhindringer er den etablerede PDTX-model tilgængelig til validering af følsomhed over for kræftlægemidler og forudsigelse af patientprognose. PDTX er helt sikkert en yderst lovende model for personlig kræftbehandling. Følgelig er globale forskningscentre optaget af at etablere en ressourcebank af PDTX. I det sidste årti har PDTX-modellen udviklet sig hurtigt. Denne model er et lovende værktøj til udvikling af lægemidler mod kræft og prædiktive biomarkører.