Free Press

Resultater og diskussion

Der er blevet rapporteret om, at konjugering af Spirogyra er blevet induceret ved at sænke kvælstofindholdet eller ved udtømning (Grote 1977; Yamashita og Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Derfor forsøgte vi først at fremkalde konjugering ved at fjerne kvælstof fra kulturmediet. Dette var imidlertid ikke vellykket. Grote (1977) rapporterede, at konjugering blev induceret i rent uorganisk closteriummedium, og at pH-værdien var vigtig. Selv om vi inkuberede algefilamenterne i et medium med forskellige pH-værdier, blev konjugationen ikke induceret. Desuden var andre forsøg, forskellige temperaturer og udtømning af forskellige næringsstoffer, ikke vellykkede. Det er blevet rapporteret, at konjugation blev induceret ved inkubation af algefilamenter under kontinuerlig belysning hos nogle Spirogyra-arter (Yamashita og Sasaki 1979). Vores materialer viste imidlertid ikke konjugation, selv når filamenter blev inkuberet uden kvælstofkilde under kontinuerlig belysning i 2 uger. Efter ovennævnte forskellige forsøg lykkedes det til sidst at fremkalde konjugation ved at inkubere filamenter på agarplade fremstillet med APW ved 23°C under en 12:12-h L-D-cyklus i 4 dage. Der blev også dannet stavformet rhizoid ved den distale ende af terminalcellerne under inkubationen. Når filamenter på agarpladen blev inkuberet i mørke, blev konjugationsfænomenet ikke fremkaldt. Allen (1958) har rapporteret, at konjugation blev induceret ved inkubation på agarplade. Hun opretholdt en stamkultur ved hjælp af Pringsheims jord-vand-medium (Pringsheim 1946) under et 16 timers lys (koldt hvidt lysstofrør)-8 timers mørke regime ved ca. 20°C. Til induktion af parring blev flere filamenter overført til 1,5% Difco agar fremstillet med destilleret vand og inkuberet ved ca. 20°C under en 16:8-timers L-D-cyklus. Efter inkubation i et par dage blev der dannet zygosporer på agarpladen. Selv om lysforholdene og temperaturen under inkubationen var forskellige, var Allens metode (1958) grundlæggende den samme som vores metode. Vi analyserede yderligere de faktorer, der var ansvarlige for konjugationsinduktion på agarpladen, som følger:

Vi spekulerede på, om nogle ukendte forurenende stoffer i agarpulveret var ansvarlige for induktion af konjugation. Vi undersøgte denne mulighed ved følgende eksperiment. Agarpulver (Wako, Osaka, Japan) blev suspenderet i APW og opbevaret ved 4 °C under omrøring natten over. Efter centrifugering (185×g, 10 min) blev den resulterende pellet vasket 2 gange med APW ved centrifugering. Den endelige agarpellet blev suspenderet i frisk APW, og der blev fremstillet plader. Konjugationen blev induceret med succes på denne agarplade. Når algefilamenter blev inkuberet i supernatant, der blev opnået ved vask af agarpulver, blev konjugationen slet ikke induceret (data ikke vist). Det var således inkubationen på agarpladen og ikke det opløselige forurenende stof, der var ansvarlig for induktion af konjugation.

Da APW ikke indeholdt kvælstofholdige kemikalier, burde agarpladen ikke indeholde noget eller meget lidt kvælstof. Derfor var det muligt, at begge faktorer, placering på agarpladen og udtømning af kvælstof, virkede synergistisk i induktionen. For at undersøge denne mulighed inkuberede vi filamenter på agarplade fremstillet med APW suppleret med 1 mM KNO3. På denne agarplade blev konjugering også induceret (fig. 1a), hvilket tyder på, at udtømning af kvælstof ikke er ansvarlig for induktion af konjugering. Endvidere blev konjugationen induceret, når filamenter blev inkuberet på agarplade fremstillet med closterium-medium, som indeholdt forskellige næringsstoffer (fig. 1b). Disse resultater viste utvetydigt, at placeringen på agarpladen i sig selv er en faktor, der er ansvarlig for induktion af konjugation.

Induktion af konjugation på agarplade blev undersøgt i andre arter, S.fuluviatilis, som differentierede rhizoid ved afskæring af algefilamenterne (data ikke vist) som i tilfældet med S. castanacea. Hos denne art blev der også induceret konjugation ved inkubation på agarplade fremstillet med APW. Vi undersøgte yderligere konjugation på agarplade hos tre Spirogyra, som ikke differentierede rhizoid. S.ellipsospora Transeau er blevet vedligeholdt i laboratoriet som en kontaminant i Chara-kultur. De to andre Spirogyra sp. indsamlet fra Biwa-søen blev bevaret som axenkultur i 6 måneder. Alle tre Spirogyra viste ikke konjugation ved inkubation på agarplade.

I nogle Spirogyra-arter blev konjugation induceret ved nedsættelse eller udtømning af kvælstofindholdet (Grote 1977; Yamashita og Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Ud over kvælstofindholdet skulle lysintensiteten og/eller pH-værdien kontrolleres hos S. majuscule (Grote 1977). Hos S. castanacea og S.fuluviatilis var inkubation på agarplade effektiv, og det var ikke nødvendigt at udtømme kvælstofindholdet (nærværende undersøgelse). På den anden side rapporterede Agrawal og Singh (2002), at Spirogyra sp. ikke påbegyndte konjugation på 2-10% agarplade. Dette svarede til vores resultater for Spirogyra sp., som ikke differentierede rhizoid. De faktorer, der er nødvendige for induktion af konjugation, er således meget variable blandt Spirogyra-arter. Vi spekulerede på, om væksthæmning var ansvarlig for induktion af konjugering på agarplade. Under inkubation på agarplader fremstillet med enten APW- eller closterium-medium formerede cellerne sig via celledeling på begge agarplader, selv om cellerne ikke påbegyndte dannelsen af konjugationsrørets papiller. Hæmning af vækst var således ikke en udløsende faktor for konjugation.

For at undersøge tilstedeværelsen af parringstypen mellem filamenter blev monoklonale kulturer af S. castanacea underkastet induktion af konjugation. Efter 48 timers inkubation blev der fundet to konjugationstyper i det samme filament (fig. 2a-c). Figur 2b viser celler med induceret scalariform konjugation (pilespids i figur 2a). På den anden side viser fig. 2c celler, der inducerer lateral konjugering (pil i fig. 2a). Zygosporerne blev normalt dannet efter den laterale konjugation (fig. 2d). Yamagishi (1977) rapporterede, at scalariform konjugation generelt observeres, mens lateral konjugation sjældent blev observeret i S.castanacea. Vores resultat var i overensstemmelse med Yamagishi’s (1977). Inden for en grænse af vores viden er induktion af både scalariform og lateral konjugering i samme filament (Fig. 2a) imidlertid den første rapport. Når to filamenter parrede sig, opførte alle celler i det ene filament sig som hanner, og cellerne i det andet filament opførte sig som hunner i de fleste tilfælde. Meget sjældent blev der imidlertid dannet zygosporer i begge filamenter (fig. 3). Parringstypen er således ikke fastlåst, i hvert fald ikke hos S.castanacea. Hypnozygoten blev dannet ved inkubation på agarpladen i ca. 1 måned. Det var imidlertid vanskeligt at fremkalde spiring på en reproducerbar måde ved at tilsætte closteriummedium til dem. Der skal findes en metode til reproducerbar induktion af spiring.

Vi undersøgte identifikation af ekstracellulære materialer, der udskilles under parringsprocessen ved hjælp af forskellige lektiner i S. castanacea. Blandt 19 undersøgte lektiner (BSL-I, BSL-II, Con A, DBA, DSL, ECL, jacalin, LEL, PHA-E, PHA-L, PNA, PSA, RCA I, SBA, SJA, STL, UEA I, VVL og WGA) farvede BSL-1, Con A, jacalin, RCA-I og SBA reproduktive celler, men ikke vegetative celler (tabel 1). Yoon et al. (2009) rapporterede, at tre lektiner, Con A, RCA og UEA, viste betydelig mærkning på ekstracellulære materialer i S. varians (Hassall) Kützing. Således synes de lektinbindende materialer, der udskilles under konjugeringen, at være forskellige i et vist omfang mellem arterne. Vi har tidligere rapporteret, at BSL-I og jacalin viste kontrasterende farvemønstre i rhizoid: jacalin farvede tydeligt omridset af rhizoidet, mens farvningen med BSL-I var diffus (Inoue et al. 1999, Ikegaya et al. 2008b). Det blev foreslået, at det BSL-I-bindende materiale var ansvarlig for filamenternes vedhæftning til substratet. På den anden side blev det jacalin-bindende materiale spekuleret i at være involveret i genkendelse af substratet (Ikegaya et al. 2008b). I den foreliggende undersøgelse fokuserede vi derfor vores opmærksomhed på BSL-I og jacalin (fig. 4). Efter 48 timers inkubation på agarplade dannede et filament, der er vist i Fig. 4a, papiller i forskellige retninger. Det blev spekuleret, at dette filament begyndte dannelsen af papiller i fravær af partnerfilamentet. Papillernes overflade blev stærkt farvet med BSL-I. Septaerne mellem cellerne var også stærkt farvet. Dernæst farvede vi et par filamenter, der begyndte konjugationen efter 48 timers inkubation. I fig. 4b blev det vurderet, at det øverste filament var hankønsgamet, og at det nederste filament var hankønsgamet, da diameteren af de nederste celler i filamentet bliver større end diameteren af det øverste filament. Konjugationsrør, der strækker sig fra parrede celler, var stærkt farvet, mens hele celleoverfladen af den kvindelige gamet var svagt farvet (fig. 4b′). Efter 72 timers inkubation var hele celleoverfladen af den hanlige gamet også svagt farvet (fig. 4c′). Efter 96 timers inkubation på agarplade blev der dannet zygosporer (fig. 4d). Konjugationsrørene var stærkt farvet (fig. 4d′), mens zygosporernes overflade ikke var farvet. Derefter blev farvning med jacalin undersøgt. Cellerne af filamenter i fig. 3e dannede papiller i samme retning. Vi spekulerede i, at dette filament startede konjugationen i nærvær af et partnerfilament, og at det gik tabt under overførslen til objektglasset. Papillerne var stærkt farvet med jacalin (fig. 4e′). Under hele konjugationsprocessen farvede jacalin hovedsageligt konjugationskanalerne (fig. 4f′-h′). Farvningsmønstret med Con A, RCA-I og SBA blev også undersøgt (data ikke vist). Con A farvede kraftigt septaerne mellem zygosporerne dannet i hunlige gameter, mens papillerne var meget svagt farvet. Når der blev dannet zygosporer, lignede farvningsmønsteret med enten RCA-I eller SBA det samme som for BSL-I, som vist i fig. 4d′.

Vi undersøger virkningen af seks lektiner, BSL-I, Con A, jacalin, RCA-I, SBA og WGA, på konjugationen. Filamenter blev præ-inkuberet i APW suppleret med et af de to lektiner i 1 dag. Derefter blev de overført til en agarplade suppleret med det samme lektin og inkuberet i 4 dage. Det blev konstateret, at jacalin hindrede dannelsen af zygospore alvorligt, men at andre ikke gjorde det (data ikke vist). En systematisk analyse viste, at jacalin hæmmer det allerførste trin, starten af papildannelsen, alvorligt (fig. 5). Dernæst blev reversibiliteten af hæmningen af jacalin undersøgt. Filamenter blev successivt inkuberet i APW suppleret med jacalin i 1 døgn og derefter i APW uden jacalin i 1 døgn. Derefter blev de inkuberet på en agarplade uden jacalin i 4 dage. Der blev imidlertid slet ikke dannet papiller. Denne irreversible hæmning kan være forårsaget af en stærk binding af jacalin. Yoon et al. (2009) rapporterede, at RCA og UEA hæmmede konjugationen. De identificerede dog ikke trinene for hæmningen. Selv om BSL-I, RCA-I, Con A og SBA også farvede konjugationsrøret, hindrede de ikke dannelsen af det. Rollerne for de materialer, der genkendes af enten BSL-I, RCA-I eller SBA, er målet for fremtidige undersøgelser.

Randhawa (1959) foreslog lighed mellem konjugationsprocesserne og rhizoiddannelsen: kontaktstimulus er involveret. På den anden side mente Kniep (1928), at konjugationsprocesserne i det væsentlige skyldtes en kemisk stimulus (citeret i Randhawa (1959)). Både konjugationsrør og rhizoid starter via dannelse af papilla og kan forlænges via spidsvækst. Konjugationsrøret dannes dog ved flanken, mens rhizoid dannes i den distale ende af cellen (Nagata 1973). Jacalin farvede tydeligt omridset af både konjugationsrøret (fig. 3e′-h′) og rhizoid (Ikegaya et al. 2008b). Jacalin hindrede ikke dannelsen af rhizoid, men hindrede differentiering til rosetteformet rhizoid (Ikegaya et al. 2008b). I tilfælde af konjugationsrør hindrede jacalin imidlertid dannelsen af papilla i sig selv (fig. 5). Det ser ud til, at jacalinbindende materialers rolle er forskellig i konjugationsrør og rhizoid.

Succes med reproducerbar induktion af konjugation i laboratoriet åbnede en vej for systematiske analyser af konjugation i Spirogyra, såsom bestemmelsesmekanisme for cellers seksualitet, rolle for lektinbindende materialer, bevægelsesmekanisme for hanprotoplast.