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By G.P. ThomasApr 15 2013

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Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ist ein chromatographisches Verfahren, das in der analytischen Chemie und Biochemie zur Auftrennung eines Gemischs von Verbindungen verwendet wird, um die einzelnen Komponenten des Gemischs zu identifizieren, zu quantifizieren oder zu reinigen.

Die Umkehrphasen-HPLC oder Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (UHPLC) ist eine häufig verwendete Trennmethode. Sie ermöglicht eine dynamische Retention von Verbindungen mit hydrophober und organischer Funktionalität. Eine Kombination aus hydrophoben und van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen der Zielverbindung und der stationären sowie der mobilen Phase ermöglicht die Retention dieser Verbindungen in umgekehrter Phase.

Wie funktioniert HPLC?

In sehr kleinen Mengen wird das zu trennende und zu untersuchende Probengemisch in einen Strom mobiler Phase geleitet, der durch eine Säule sickert. Es gibt verschiedene Arten von Säulen mit Sorptionsmitteln unterschiedlicher Teilchengröße und Oberfläche.

Das Gemisch bewegt sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die Säule und interagiert mit dem Sorptionsmittel, das auch als stationäre Phase bezeichnet wird. Die Geschwindigkeit jedes Bestandteils des Gemischs hängt 1) von seiner chemischen Beschaffenheit, 2) von der Art der Säule und 3) von der Zusammensetzung der mobilen Phase ab. Die Zeit, in der ein bestimmter Analyt aus der Säule austritt, wird als Retentionszeit bezeichnet. Die Retentionszeit wird unter bestimmten Bedingungen gemessen und als identifizierendes Merkmal eines bestimmten Analyten betrachtet.

Sorptionsmittelpartikel können hydrophob oder polar sein. Zu den üblicherweise verwendeten mobilen Phasen gehört jede mischbare Kombination aus Wasser und organischen Lösungsmitteln wie Acetonitril und Methanol. Es können auch wasserfreie mobile Phasen verwendet werden.

Die wässrige Komponente der mobilen Phase kann Säuren wie Ameisen-, Phosphor- oder Trifluoressigsäure oder Salze enthalten, um die Trennung der Probenkomponenten zu ermöglichen. Die Zusammensetzung der mobilen Phase wird entweder konstant gehalten oder während der chromatographischen Analyse variiert. Der konstante Ansatz eignet sich für die Trennung von Probenbestandteilen, die sich in ihrer Affinität zur stationären Phase nicht sehr unterscheiden. Bei der variablen Methode variiert die Zusammensetzung der mobilen Phase von einer niedrigen zu einer hohen Elutionsstärke. Die Elutionsstärke der mobilen Phase spiegelt sich in den Retentionszeiten der Analyten wider, wobei eine hohe Elutionsstärke zu einer schnellen Elution führt.

Die Zusammensetzung der mobilen Phase wird auf der Grundlage der Intensität der Wechselwirkungen zwischen mehreren Probenkomponenten und der stationären Phase ausgewählt.

Das HPLC-Verteilungsverfahren ist dem Flüssig-Flüssig-Extraktionsverfahren recht ähnlich, mit dem Unterschied, dass es sich bei ersterem um einen kontinuierlichen Prozess handelt, während letzteres ein schrittweises Verfahren ist. Es wird empfohlen, Trennungsversuche durchzuführen, um die genaue HPLC-Methode zu bestimmen, die eine angemessene Trennung ermöglicht.

Hersteller von HPLC-Systemen

Es gibt heute eine große Auswahl an HPLC-Optionen auf dem Markt. Im Folgenden finden Sie eine Liste verschiedener HPLC-Systemhersteller mit einer kurzen Vorstellung ihrer Produkte:

• Dionex, ein Unternehmen, das auf der Wissenschaft der Chromatographie basiert, stellt das UltiMate® 3000 Rapid Separation LC-System, das UltiMate 3000 RSLCnano-System und die Corona®-Familie universeller geladener Aerosoldetektoren her.
• Jasco Analytical Instruments bietet eine Reihe von HPLC-Systemen an. Die HPLC-Systeme der Serie LC-2000 Plus sind einzigartig konfigurierbar. Mit hoher Leistung und niedrigen Kosten können diese HPLC-Systeme an praktisch jede Anforderung angepasst werden, von der einfachen isokratischen QA bis hin zur fortschrittlichen Multilösungs-/Mehrsäulen-Methodenentwicklung. Das isokratische LC-2000plus-Iso ist mit einer Pumpe, einem Entgaser, einem Autosampler und einem UV/Vis-Detektor ausgestattet. Die Pumpe ist für Flussraten von 1µL bis 10mL/min bei einem Druck von bis zu 500 bar ausgelegt und kann mit 2, 3, 4, 6 und bis zu 10mm ID Säulen verwendet werden. Das Binary Gradient LC-2000plus-HPG ähnelt dem isokratischen System, ist jedoch mit einer Zwei-Lösungsmittel-Gradienten-Pumpenkonfiguration ausgestattet. Die Flussraten der Pumpe sind mit 1mm-Säulen kompatibel. Das Quaternary Gradient LC-2000plus-LPG ähnelt ebenfalls dem isokratischen System; dieses Modell ist jedoch mit einer quaternären Gradientenpumpenkonfiguration für maximale Lösungsmittelflexibilität ausgestattet.
• Das präparative HPLC-System von Gilson verfügt über einen breiten Flussbereich, der sowohl für semipräparative als auch für präparative Trennungen angepasst werden kann. Seine hohe Pumpleistung ermöglicht eine große Auswahl an präparativen Säulengrößen. Das System ist mit einem neuen Spülstationssystem ausgestattet, das einen fließenden Waschstrahl umfasst und die Verwendung von bis zu zwei verschiedenen Spüllösungsmitteln ermöglicht.
• Sharp™ HPLC-Systeme von AAPPTec sind mit mikroprozessorgesteuerten Pumpen ausgestattet, die hochpräzise und hochgenaue Flussraten ermöglichen, wodurch eine ausgezeichnete analytische Reproduzierbarkeit und höchste Messgenauigkeit erzielt werden kann.

Weitere Hersteller auf dem derzeitigen Markt sind Agilent, Beckman Coulter, Bio-Rad und Buck Scientific.

Vorteile der HPLC

Die Hauptvorteile von HPLC-Systemen sind wie folgt:

• Steuert und automatisiert die Chromatographie-Instrumentierung
• Bietet Datenmanagement, Sicherheitsfunktionen sowie Berichterstattung und Gerätevalidierung.
• Leistungsfähig und anpassungsfähig
• Steigert die Produktivität durch die Verwaltung aller Bereiche der Analyse – von der Probe bis zum Gerät und von der Trennung bis zur Berichterstellung
• Erschwinglich

Anwendungen der HPLC

Der Hauptzweck der HPLC-Technik ist die Identifizierung, Quantifizierung und Reinigung eines bestimmten Analyten oder einer Verbindung. Es können sowohl quantitative als auch qualitative Analysen durchgeführt werden. HPLCs können in den folgenden Anwendungen eingesetzt werden:

• Wasserreinigung
• Nachweis von Verunreinigungen in der pharmazeutischen Industrie
• Vorkonzentration von Spurenkomponenten
• Ligandenaustauschchromatographie
• Ionenaustauschchromatographie von Proteinen
• Hoch-pH-Anionen-Austauschchromatographie von Kohlenhydraten und Oligosacchariden

Quellen und weiterführende Literatur

• Umkehrphasen-HPLC/UHPLC-Chromatographie-Phenomenex
• Dionex Produkte-Dionex
• HPLC Systeme-aapptec
• Präparatives HPLC System-Gilson

Dieser Artikel wurde aktualisiert am 22. April, 2019.

Geschrieben von

G.P. Thomas

Gary schloss sein Studium der Geochemie an der University of Manchester mit einem erstklassigen Prädikatsexamen und einem Master in Erdwissenschaften ab. Nachdem er in der australischen Bergbauindustrie gearbeitet hatte, beschloss Gary, seine Geologiestiefel an den Nagel zu hängen und sich dem Schreiben zuzuwenden. Wenn er nicht gerade aktuelle und informative Inhalte entwickelt, findet man Gary normalerweise beim Spielen seiner geliebten Gitarre oder beim Zuschauen, wie der Aston Villa FC die Niederlage aus den Klauen des Sieges reißt.

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