Free Press

Abstract

Die Acetylierungsmechanismen mehrerer ausgewählter typischer Substrate aus Experimenten, einschließlich Arylaminen und Arylhydrazinen, werden in dieser Arbeit mit der Dichtefunktionaltheorie untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass alle Übergangszustände durch eine viergliedrige Ringstruktur charakterisiert sind, wobei Hydralazin (HDZ) das potenteste Substrat ist. Die Bioaktivität aller Verbindungen erhöht sich in der Reihenfolge PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ. Der Konjunktionseffekt und die Delokalisierung der einsamen Paare des N-Atoms spielen eine Schlüsselrolle bei der Reaktion. Alle Ergebnisse stimmen mit den experimentellen Daten überein.

1. Einleitung

Die Arylamin-N-Acetyltransferasen (NATs, EC 2.3.1.5) sind Phase-II-Stoffwechselenzyme, die sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten vorkommen. Die N-Acetylierungsreaktion führt zur Entgiftung von Arylamin-Xenobiotika und leitet schließlich zu elektrophilen Arylnitrenium-Ionen über, die für die Bildung von DNA-Addukten verantwortlich gemacht werden. Die beiden funktionellen NAT-Isoenzyme, NAT1 und NAT2, weisen trotz einer 81%igen Aminosäuresequenzidentität große Unterschiede in der Substratspezifität und der Gewebeverteilung auf. Letzteres, NAT2, wird vorwiegend in Leber und Darmepithel exprimiert. Frühere Studien haben angenommen, dass NATs einen Acetyltransfer durch einen klassischen kinetischen Ping-Pong-Mechanismus katalysieren (Schema 1). Die Analyse der ortsgerichteten Mutagenese von menschlichem NAT2 und Salmonella typhimurium NAT (StNAT) legte nahe, dass ein Cysteinrest im aktiven Zentrum für die Vermittlung des Acetylierungsprozesses verantwortlich ist. Kürzlich durchgeführte kinetische Studien zu p-Nitrophenylacetat (PNPA) und NAT2 zeigten, dass der katalytische Mechanismus von NAT2 von der Bildung eines Thiolat-Imidazolium-Paares abhängen könnte. Obwohl das Enzym sowohl in Eukaryonten als auch in Prokaryonten vorkommt, ist die endogene Rolle der NATs noch unklar. Die Substratbestimmung ergab, dass sowohl Arylamine als auch Arylhydrazine durch NATs acetyliert werden können. Die erforderlichen Schritte der Acetyltransferreaktion bestehen aus der Übertragung der Acetylgruppe vom Cysteinrest im aktiven Zentrum auf das Substrat und der Entfernung eines Protons von letzterem auf ersteres. In dieser Arbeit ist eine detaillierte theoretische Studie über das Verhalten von Arylaminen und Arylhydrazinen als Substrate bei der Acetylierung verfügbar, einschließlich der Eigenschaften ihrer Strukturen, der Übergangszustände und der Energieprofile.

2. Methoden

Alle Berechnungen wurden mit der Dichtefunktionaltheorie (DFT) B3LYP-Methode durchgeführt, wie sie im Programmpaket Gaussian03 implementiert ist, das bereits erfolgreich für eine Reihe von Enzymsystemen eingesetzt wurde. Bei Verwendung der Basissätze 6-31G* und 6-311+G (3df, 2p) wurde das B3LYP-Hybridfunktional den Hartree-Fock (HF)- und MP2-Methoden vorgezogen. Obwohl sie manchmal bei der Behandlung von dispersionsreichen Wechselwirkungen versagt, wurde die B3LYP-Methode erfolgreich auf viele biologische Systeme angewendet.

Die Geometrien aller Reaktanten, Zwischenstufen und Produkte werden auf dem B3LYP/6-31G*-Theorieniveau optimiert. Die stabilsten Konformationen sowie ihre Energien bei jedem Gleichgewicht und den Übergangszuständen wurden ermittelt. Frequenzberechnungen wurden für alle resultierenden stationären Punkte durchgeführt, und jeder Übergangszustand hat nur eine imaginäre Frequenz. Außerdem wird die MP2/6-311+G**-Methode auf die optimierten Strukturen der stationären Punkte angewendet, um genauere Energieprofile zu erhalten. Wenn nicht speziell darauf hingewiesen wird, beziehen sich alle folgenden Energieanalysen auf die Ergebnisse von MP2/6-311+G**//B3LYP/6-31G (d)-Berechnungen.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Die Grenzobitale der Substrate

Sechs Substrate, p-Aminobenzoesäure (PABA), 4-Methoxylanilin (4-MA), 4-Aminosalicylat (4-AS), 5-Aminosalicylat (5-AS), Isoniazid (INZ), Hydralazin (HDZ), wurden entsprechend den Referenzen ausgewählt, die in zwei verschiedene Familien unterteilt werden können: Arylamine und Arylhydrazine. Die Energien für die Grenzobjekte (einschließlich HOMO-2, HOMO-1, HOMO, LUMO, LUMO+1 und LUMO+2) aller sechs Substrate sind in Tabelle 1 aufgeführt, die in bioenzymatischen Systemen eine wichtige Rolle spielen. Bei den Arylaminen verringern sich die HOMO-Energien in der Reihenfolge 4-MA > 5-AS > PABA > 4-AS, was auf eine Zunahme ihrer nukleophilen Reaktivität hinweist. Von allen sechs Substraten (siehe Abbildung 1 in den ergänzenden Materialien, online verfügbar unter doi: 10.1155/2009/783035) hat INZ die größte Energielücke zwischen HOMO und LUMO, was auf seine Stabilität schließen lässt. Die Ergebnisse der Natürlichen Populationsanalyse (NPA) zeigten, dass die aktiven Amino-N-Atome der Arylamin-Familie elektronegativer sind als die der Hydrazin-Gruppe, was hauptsächlich auf den Konjugationseffekt zurückzuführen ist.

Obwohl PABA und 4-AS unterschiedliche Substitutionen an der p-Stelle der Aminogruppe am sechsgliedrigen Ring aufweisen, ist ihre Bioaktivität nahezu gleich. Eine intermolekulare H-Bindung stabilisiert das Substrat selbst mit einem Energieabfall von etwa 19-21 kJ/mol. Sowohl die HOMO- als auch die LOMO-Energien für 5-AS sind höher als die von 4-A𝑆s, was darauf hindeutet, dass ersteres reaktiver ist als letzteres.

Bei den Arylhydrazinsubstraten wird das einsame Paar der N-Atome am Rückgrat des sechsgliedrigen Rings im gesamten System delokalisiert, um seine Stabilität zu erhöhen. Der 𝐸(𝐿-𝐻)-Wert von HDZ ist um 0,0318 a.u. höher als der von INZ, was auf eine höhere Reaktivität als bei INZ hinweist.

3.2. Die verschiedenen Wege und Übergangszustände

Im Prinzip können alle Substrate mit dem Cysteinrest des aktiven Zentrums über einen konzertierten Weg oder einen schrittweisen Weg reagieren. Im ersten Fall kommt es in den Übergangszuständen (siehe Abbildungen 1 und 2) zu einer konzertierten Übertragung des Wasserstoffs H5 auf das S1-Atom des Cysteins und zu einer Bindungsbildung zwischen N4- und C2-Atomen. Der Bruch alter Bindungen (N4H5 und S1C2) und die Bildung neuer Bindungen (C2N4 und S1H5) finden gleichzeitig statt. Die Reaktanten und die Zielprodukte sind durch den einzigen Übergangszustand auf der potentiellen Energieoberfläche (PES) verbunden. Die wichtigsten Strukturdaten aller Übergangszustände sind in Tabelle 1 des Zusatzmaterials aufgeführt. Beim schrittweisen Mechanismus wird zunächst das H5-Atom auf das O3-Atom der Carbonylgruppe übertragen, wobei über den Übergangszustand stw-ts1 eine neue Bindung zwischen N4 und C2-Atom entsteht. Anschließend wird ein Thiolester-Zwischenprodukt (intmed) gebildet. Folglich findet die zweite Wanderung von H5 von der Hydroxylgruppe zum S1-Atom über stw-ts2 zusammen mit dem Bruch der S1-C2-Bindung statt, was schließlich zu den Produkten führt.

Abbildung 1

Die konzertierten und schrittweisen Wege für die von Arylamin-N-Acetyltransferasen katalysierte Reaktion.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Abbildung 2

Die Struktur der Übergangszustände sowohl für den konzertierten als auch für den schrittweisen Weg von PABA.

Die Ergebnisse zeigen, dass alle Übergangszustände durch eine viergliedrige Ringstruktur gekennzeichnet sind, die nahezu planar ist. In jedem Übergangszustand gibt es zwei kleine Winkel von weniger als 80° (C2S1H5 und S1C2N4 für con-ts, C2O3H5 und C2N4H5 für stp-ts1, C2S1H5 und S1C2O3 für stp-ts2), die das gesamte System stark belasten und es instabil machen. Unter den sechs konzertierten Übergangszuständen (con-ts) aller Substrate sind die Eigenschaften der Bindung C2N4, N4H5 und S1H5 für alle Substrate ungefähr gleich, während die Wechselwirkung zwischen S1 und C2 einer der entscheidenden Faktoren für den konzertierten Schritt ist.

Anders verhält es sich bei den schrittweisen Pfaden. Die Hybridisierungsänderungen des C2-Atoms folgen einer ähnlichen Tendenz (𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3) für alle Substrate während der schrittweisen Acetylierung (Tabelle 1 ergänzend). Die erste Migration von H5 führt zum Übergangszustand stp-ts1, und dann befindet sich ein Zwischenprodukt namens intmed auf der potenziellen Energieoberfläche (PES), die ein lokales Minimum darstellt. Dabei handelt es sich um ein tetraedrisches Thiolester-Zwischenprodukt, wie es in früheren experimentellen Studien vorgeschlagen wurde. Es ist kurzlebig und ein konsequenter H5-Transfer wird bald über den Übergangszustand stp-ts2 stattfinden. Für den schrittweisen Weg unterscheiden sich die Strukturen der Übergangszustände für verschiedene Substrate nur geringfügig von anderen. Die 3D-Strukturen der Übergangszustände wurden für PABA aufgelistet (Abbildung 2), die anderen waren denen ähnlich.

3.3. Die Energien

Die relativen Energien aller möglichen Pfade für die sechs Substrate werden auf der Grundlage der Energiesumme der Reaktanten, die als Null angenommen wird, durchgeführt (Abbildung 3). Aus Abbildung 3 geht hervor, dass die konzertierten Pfade gegenüber den schrittweisen Pfaden bevorzugt werden. Die Energiebarrieren der konzertierten Übergangszustände (con-ts) sind niedriger als die der schrittweisen (stp-ts1) in einem Bereich von 83,5 kJ/mol bis 26,9 kJ/mol (Tabelle 2). Die Arylhydrazine sind bessere Substrate als die Arylamine, und HDZ ist das reaktivste mit der niedrigsten Aktivierungsenergie, was mit den experimentellen Daten gut übereinstimmt. Diese Schlussfolgerung kann auch aus der Analyse der Strukturdaten gezogen werden (Tabelle 1). Der verstärkte Konjunktionseffekt und die Delokalisierung der Stickstoff-Lone-Pairs am Rückgrat stabilisierten den Übergangszustand. Die Bioaktivität für alle Substrate ist in einer Sequenz von PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ erhöht.

Abbildung 3

Die Energieprofile für alle Substrate.

4. Schlussfolgerungen

Die folgenden Schlussfolgerungen können gezogen werden.

(i)Alle Substrate können über zwei verschiedene Wege acetyliert werden: den konzertierten und den schrittweisen, wobei der erstere aufgrund der niedrigeren Aktivierungsenergien bevorzugt wird.(ii)Nach unseren Berechnungen sind die Arylhydrazine bessere Substrate als die Arylamine, und HDZ ist das reaktivste mit der niedrigsten Aktivierungsenergie. Die Bioaktivität für alle Substrate steigt in der Reihenfolge PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ, was mit den experimentellen Ergebnissen sehr gut übereinstimmt. (iii) Der Konjunktionseffekt und die delokalisierten einsamen Paare spielen bei der Acetylierung eine sehr wichtige Rolle. Der verstärkte Konjunktionseffekt und die zunehmende Anzahl der einsamen Paare am sechsgliedrigen Ring führen zu einer niedrigeren Energiebarriere.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Scientific Foundation of China (no.20603030, no.20873074, and no.10674114), das 973-Projekt des chinesischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (Nr. 2009CB930103), die Natural Scientific Foundation der Provinz Shandong (Nr. Q2008B07) und die Stiftung für kreative Forschungsgruppen der Ludong-Universität (Nr. 08-CXA001).

Ergänzende Materialien