Free Press

BEVEZETÉS

Az állatmodellek fontos szerepet játszanak a gyógyszerfejlesztésben és a molekuláris biológiai mechanizmusok vizsgálatában. Történelmileg a nyúlban a kőszénkátrány által kiváltott bőrrákmodell váltotta ki a karcinogénnel kiváltott egérmodell kifejlesztését. Különböző állatmodelleket hoztak létre a karcinogének előrejelzésének és a karcinogén mechanizmusok vizsgálatának értékelő eszközeként (1). A krónikus karcinogén expozíciót alkalmazó megközelítés azonban időigényes és költséges, ami korlátozza alkalmazását a gyógyszerfejlesztésben. Mindazonáltal az egérmodellek még mindig vonzóbbak a nagy állatmodelleknél az alacsony költségek, a könnyű kezelhetőség és az ismert genetikai információk miatt (2). Nemrégiben kifejlesztettek egy egérsejtvonalakkal befecskendezett szingénikus egérmodellt (3). E modell előnyei a reprodukálhatóság, a különböző tumortípusok könnyű indukálhatósága és az immunkompetencia. Másrészt ez a modell gyakran eltérő választ mutat a humán rákos sejteken végzett in vitro vizsgálatok eredményeihez képest. Ennek a hátránynak a kiküszöbölésére a Nemzeti Rákintézet (NCI) olyan módszert alkalmazott, amelyben humán rákos sejteket injektálnak immunhiányos egérbe. Az NCI nyolc különböző rákos sejtvonalából (agy, vastagbél, leukémia, tüdő, melanoma, petefészek, prosztata és vese) xenograft modellek sorozatát fejlesztették ki. Ezenkívül különböző egérmodellek létrehozására szolgáló módszereket dolgoztak ki az új gyógyszerek hatékonyságának és toxicitásának értékelésére. Az egyik modell a genetikailag módosított egérmodell (GEMM), amely a karcinogenezis mechanizmusainak és a gyógyszerrezisztenciának az értékelésére szolgáló fejlett módszer (4). A GEMM modellhez immunkompetens egereket használnak, hasonlóan a szingénikus modellhez. Ez a modell tehát lehetővé teszi az immunadjuvánsok fejlesztésének alkalmazását a rák kezelésére. Ezenkívül ez a modell hasznos a biológiai folyamatok felderítésére, valamint a tumorsejtek és mikrokörnyezetük vizsgálatára, de nagyon drága, heterogén és bonyolult. Ráadásul a daganatok gyakorisága, fejlődése és növekedése nem esik egybe a GEMM modellben (4-7). Számos kutató dolgozott ki stratégiát a preklinikai értékelésre a terápiás potenciál meghatározására és a humán tumorkörnyezet utánzására. A GEMM-modell mellett az in vivo xenograft modellek athymikus meztelen egereket és súlyos kombinált immunhiányos (SCID) egereket használnak a humán rákos sejtek vagy a beteg tumorszövet beültetésére a transzlációs kutatásban a klinikai vizsgálatokhoz (8,9). Ebben az áttekintésben a daganatos xenograft modellek típusai és jellemzői a rákellenes gyógyszerek fejlesztésében való felhasználásra összpontosítanak.

Ektopikus tumor xenograft modell. Általában emberi rákos sejteket szubkután injektálnak az egerek hátsó lábába vagy hátába (1A ábra). Az ektopikus tumor xenograft modellben (ektopikus modell) a transzplantált hely különbözik a tenyésztett sejtek eredetétől. Az ektopikus modell az onkológiai vizsgálatokban validálásra és értékelésre használt standard rákmodell. Miután az NCI-ben létrehozták a rákellenes szűrésre szolgáló rákos sejtvonalakat, az ezekből a sejtvonalakból származó xenograft modelleket fejlesztették ki. A xenograft modellek létrehozásához nyolc szervből származó hatvan sejtvonalat használtak, és olyan információkról számoltak be, mint a daganat megduplázódási ideje és a tumorigenitási ráta (1). Az 1. táblázatban a humán rákos sejtvonalakban a xenograft modell reprodukálható felvételi aránya több mint 90% volt. Az in vitro szűrővizsgálatból nyert vezető vegyületek értékeléséhez ez a modell bebizonyította, hogy ugyanazok a rákos sejtek hasznosak és előrejelzőek lehetnek, ami segít az alkalmazható rákos vegyület kiválasztásában a klinikai vizsgálatba való átültetéshez.

Mivel az ektópiás modell könnyen nyomon követhető a tumorigenitás és a tumor növekedése, számos kutató használta ezt a modellt a rákellenes hatékonyság értékelésére (10-12). A tumor térfogatát (V) a tumor legnagyobb hosszából és legrövidebb hosszából számítják ki (1. egyenlet). Ezen adatok alapján számos paraméterből értékelhető a rákellenes aktivitás. A kezelt csoport (T) és a kontrollcsoport (C) arányát (optimális % T/C), a tumor növekedésének késleltetését és a tumor regresszióját használták (13-15). Meghatározták a gyógyszerrel összefüggő halálozást (DRD) és a testtömeg-változást mint a toxicitás paramétereit. A DRD az állatok 15 napon belüli halálát jelentette, a kezelt egerek testtömegének a kontrollhoz viszonyított több mint 20%-os csökkenését pedig káros hatásnak tekintették.

Ezek a paraméterek segítenek a vezető vegyület kihúzásában a gyógyszerszűrésből. Alkalmanként a daganattípusoktól függő gyógyszerreakciót egyéni különbségek nélkül is össze lehetett hasonlítani, mivel kétféle rákos sejtet spontán át lehetett ültetni ugyanabba az egérbe, és a két daganat növekedési különbségeket mutathatott (16). Továbbá az ektópiás modell nagyon jól reprodukálható, homogén és jól használható.

Mindenesetre nem minden tumor használható értékelő eszközként, mert egyes tumorok a tumorigenitás során nekrózist mutatnak, és egyes tumorok nem szilárdak (nem szubsztanciálisak). Az állatmodellek készítéséhez használt immunszupprimált egerek más mikrokörnyezetet képviselnek, mint a humán rák. Ezért az invázió és az áttétképződés értékelése korlátozott ebben a modellben.

Orthotopikus tumor xenograft modell. A tumorérzékenység értékelésére alternatív modelleket fejlesztettek ki. Az ortotópos tumor xenograft modell (ortotópos modell) fejlett eszköz, de immunszuppresszív egér mikrokörnyezeten alapul. Az ortotópos modellben a humán rákos sejteket a tumor azonos származási helyére ültetik át. Az ortotópos modellhez például a tüdőráksejteket közvetlenül az egértüdőbe injektálták (1B. ábra). Ebben a modellben a reprodukálhatóság biztosítása érdekében jól képzett, sebészeti ismeretekkel rendelkező szakértőre van szükség. A tumorigenitás felvételi arányát nehéz kiszámítani, mivel a melanoma kivételével szinte minden tumor láthatatlan a szabad szem számára. Ezenkívül az ortotópiás modellek a szubkután ektópiás modellekkel ellentétben csak a tumor növekedésének áldozat nélküli mérésére korlátozódnak. A mai napig a képalkotás a választott módszer a növekvő tumorok progressziójának ortotópos modellekben történő nyomon követésére. Jelenleg a fluoreszcenciát vagy luciferázt expresszáló rákos sejtvonalakkal ortotópos modelleket optikai képalkotással, számítógépes tomográfiával (CT) vagy mágneses rezonanciás képalkotással (MRI) figyelik (17). A karcinogenezis értékeléséhez és a tumor növekedésének áldozat nélküli meghatározásához drága berendezésekre van szükség, ezért ennek a modellnek az elérhetősége korlátozott. Mindazonáltal ez a modell klinikailag releváns a beteghez hasonló progressziós folyamat (pl. invázió) szempontjából. Ho és munkatársai jelentése szerint az ortotópos tumorok gyorsabb korai stádiumú tumornövekedést, angiogenezist és az erek hiperpermeabilitását mutatják az ektopikus tumorokhoz képest (18). Egyes ráktípusoknál metasztázis kialakulását is megfigyelték. Például az ortotópos emlőzsírpárna tumorimplantátum modell az emlőrák esetében is jó modell. Ebben a modellben a spontán tumormetasztázisok hasonlítanak a humán emlőrák természetes progressziójára (19). Ezért a rákellenes aktivitás és az áttétképződés gátlása ugyanabban a modellben értékelhető. Az alábbiakban részletesen ismertetjük az áttétes modellt.

Metasztatikus rákmodell. Az ultraibolya, ionizáló sugárzásnak és rákkeltő anyagoknak való kitettség következtében helyileg kialakuló daganatok invázió útján keringenek az erekben és a nyirokcsomókban, metasztázist (másodlagos rákot) okozva az invázióra alkalmas helyeken. Paget mag és talaj hipotézise szerint az elsődleges rákos sejt (mag) metasztázist kezdeményez egy megfelelő környezetben (talaj), például a tüdőben, a májban, a csontban, a nyirokban és az agyban (20). A legújabb kutatások az áttétképződés mechanizmusainak vizsgálatán alapuló metasztázisgátlók és megelőző gyógyszerek kifejlesztését ösztönözték, de nem állt rendelkezésre olyan preklinikai értékelő eszköz, amely a klinikai vizsgálat jóváhagyásához szükséges irányelveket meghatározta volna.

A metasztázismodell létrehozására különböző módszereket dolgoztak ki, és kétféle humán xenograft modell létezik. Először is, az ortotópiás transzplantációban a transzplantált tumorsejtekből keletkezik az elsődleges tumor, a tumort eltávolítják, majd megfigyelik az áttétképződést. Például a WM239 melanomasejteket súlyos kombinált immunhiányos (SCID) egerekbe ültették át, és az elsődleges daganatot 4 hét után izolálták. Ezután tüdőmetasztázist figyeltek meg (21). Az ortotópos modellt prosztatarákos sejtekből (DU145) készítették, és az eltávolított nyirokcsomót tenyésztették, majd az izolált tumorsejteket újra befecskendezték egerekbe, hogy metasztázismodellt kapjanak (22). Másodszor, a rákos sejteket intravénásan nude (1C ábra) vagy SCID egerekbe injektálták, ahol rákos őssejtként keringtek és metasztázist váltottak ki (23). Ez a modell gyorsabban keletkezett, mint az előbbi modell. Az ektópiás és ortotópiás modellek hibridjében fluoreszcenciát kifejező HT- 29 sejteket (humán vastagbélrák) szubkután injektáltak az ektópiás helyre, és több darab HT-29 sejtből származó daganatot ültettek át a vastagbélbe, majd megfigyelték az áttétképződést (24). Általában SCID egerekben könnyebben elérhető a metasztázis modell, mint meztelen egerekben. Mivel az ortotópiás modellhez hasonlóan az áttétképzés – a bőrrák esetét kivéve – nehezen megfigyelhető külsőleg (25), genetikailag módosított sejtvonalakat (fluoreszcens (24) vagy luciferázt expresszáló sejteket (26)) használtunk, és in vivo optikai képalkotással követtük nyomon. Gyakran alkalmazzák ezt a modellt a theragnosztikában, amely magában foglalja az MRI vagy pozitronemissziós tomográfiás (PET) képalkotást (27) a diagnózis és a megfelelő rákellenes terápia egyidejű meghatározása érdekében. A mai napig nem alakultak ki irányelvek az áttétképzésnek a gyógyszerfejlesztés értékelő eszközeként való alkalmazására. További vizsgálatokra van szükség a reprodukálhatósággal, az áttétképzés hátterében álló mechanizmusokkal és a markerekkel kapcsolatban.

Páciensből származó tumor xenograft modell. A xenograft modellek, előnyeik ellenére, korlátozottan képesek annak bemutatására, hogy egy rákos beteg hogyan reagálna egy adott kezelésre. A gyógyszerre adott válasz megbízható előrejelzésére van szükség egy klinikai vizsgálatban, és a jelenlegi modellek nem elegendőek. E modellek hiányosságainak kiküszöbölésére egy betegből származó tumor xenograftot (PDTX) fejlesztettek ki és használtak fel (28,29). Mivel a PDTX során a rákos beteg szövetét közvetlenül immunhiányos egerekbe ültetik át (1D ábra), a genetikai információk és az immunhisztológiai markerek korrelálnak a beteggel, és alkalmazhatók az új rákellenes gyógyszerek (30) és a személyre szabott rákterápiák értékelésére. A PDTX számos előnye a következőképpen foglalható össze: 1

A PDTX-modellnek azonban technikai korlátai vannak, valamint drága és időigényes. Leginkább a frissen kimetszett primer humán tumorokat kell néhány órán belül a műtőből a laboratóriumba szállítani. Ezzel egyidejűleg a primer humán tumorok egy mintáját immunhisztológiai elemzéssel kell megvizsgálni. Ezért együttműködésre van szükség a sebész, a szövettanár és a kutató között. Ezután az eredeti primer humán tumorok összehasonlíthatók a passzivált tumortranszplantátum tumorszöveteivel. Ezenkívül az intézményi felülvizsgálati bizottság (IRB) jóváhagyása szükséges, mivel a betegből származó tumorszövet felhasználása klinikai és etikai megfontolásokkal jár. Ezen erőfeszítések ellenére a PDTX átvételi aránya körülbelül 25% (31-33), és a PDTX létrehozása körülbelül három hónapot vesz igénybe az első passzázsig (az adatok nem láthatóak). A xeno-szervtranszplantációhoz hasonlóan a SCID egerekbe történő első transzplantációra van szükség az akut immunrejekció elkerülése érdekében, és ez költséges. Ezenkívül a betegből származó tumorszövet mennyisége nagyon korlátozott, ezért a PDTX populációszámát tumorszövet-passzázs útján kell növelni. ezzel párhuzamosan a tumorszövetek minden egyes passzázsát szövettanilag elemezni kell, és össze kell hasonlítani az eredeti szövetekkel. A második passziótól kezdve nude egerek használhatók. A tumorszövetdarabokat le lehet fagyasztani és folyékony nitrogénben tartósítani.

A fenti akadályok ellenére a létrehozott PDTX modell a rákellenes gyógyszerérzékenység validálására és a betegek prognózisának előrejelzésére áll rendelkezésre. A PDTX minden bizonnyal rendkívül ígéretes modell a személyre szabott rákterápia számára. Ennek megfelelően globális kutatóközpontok foglalkoznak a PDTX erőforrásbank létrehozásával. Az elmúlt évtizedben a PDTX modell gyorsan fejlődött. Ez a modell ígéretes eszköz a rákellenes gyógyszerek és a prediktív biomarkerek fejlesztéséhez.