Results
Imaging cAMP in de primaire cilium van levende cellen met behulp van fluorescerende biosensoren presenteert een aantal unieke uitdagingen. Ten eerste, cilia zijn klein en slank, steekt 2-10 µm boven het oppervlak van de cel, ten tweede, terwijl niet-beweeglijk, ze zijn onderhevig aan beweging als gevolg van bulk stroom in de badoplossing, en ten derde, bonafide ciliaire signalen kan moeilijk zijn om optisch te scheiden van achtergrond fluorescentie afkomstig van het cellichaam. Terwijl verschillende cilium-gerichte cAMP reporters zijn eerder beschreven (19, 24, 25), hebben we geprobeerd om ratiometrische biosensoren met verbeterde helderheid en targeting trouw te genereren. Na het testen van tal van ontwerpen, vonden we de beste targeting, helderheid en gevoeligheid werden aangeboden door de vierde generatie Epac-gebaseerde probes uit het laboratorium van Kees Jalink (EpacH188 en een hogere affiniteit versie, EpacH187) (26) in combinatie met Arl13b, een eiwit zeer gelokaliseerd cilia (27) (Fig. 1A). Sensoren waarin de 5-HT6 receptor gaf vergelijkbaar goede lokalisatie als Arl13b-gekoppelde probes; echter, zoals hieronder besproken, 5-HT6 receptoren niet gelokaliseerd op cilia veroorzaakt verhoging van cellulaire cAMP als gevolg van de bekende constitutieve activiteit van deze GPCR (28).
cAMP signalering in cilia van digitonine-permeabilized cellen. Alle experimenten werden uitgevoerd in intracellulair-achtige buffer aangevuld met ATP en GTP. (A) mIMCD3 cellen die 5-HT6-mCherry en Arl13b-H187 gelokaliseerd op zowel de cel en cilium niet reageren op 10 µM 5-HT in het cellichaam of in het cilium na 2 min behandeling met 20 ug / ml digitonine (4 experimenten, 5 cilia). (B) Ook responsiviteit op de inverse agonist, 1 µM SB742457, en de daaropvolgende 5-HT6 rebound respons werden verloren in zowel de cel en cilium na 2 min behandeling met 20 ug / ml digitonine (3 experimenten, 3 cilia). (C) Digitonine permeabilisatie ablated de 50 µM forskolin-geïnduceerde cAMP signaal in cellichamen, maar cAMP toename was detecteerbaar in cilia; 1 mM IBMX-geïnduceerde PDE remming niet ontmaskeren signaal (n = 4 experimenten met 4 cilia / 7 cellen). (D) AC3 cotransfectie veranderde de forskolin respons niet. (E) Kwantificering en vergelijking van cAMP respons op forskolin in cellichamen en in cilia; **P = 0.0002, ***P = 00019. Blauwe sporen = cellichaam, rode sporen = cilia. Tijdsstaven: 3 min. De y-as is de 480/535 nm ratio.
Een voor de hand liggende verklaring voor het gebrek aan effect in de voorgaande experimenten was dat cAMP niet voldoende accumuleren om te worden opgevangen door de reporter. Echter, wanneer hetzelfde experiment werd herhaald met forskolin om direct endogene AC’s (adenylyl cyclasen) aanwezig in de ciliaire membraan te activeren, een kleine maar consistente accumulatie van cAMP werd gedetecteerd in de micro-omgeving van het cilium, maar niet in het cellichaam (Fig. 4 C en E, linker staafdiagrammen). Vergelijkbare resultaten werden verkregen in cellen tot expressie AC3 (36) (Fig. 4 D en E, rechts staafdiagrammen), die werd gelokaliseerd cilia wanneer uitgedrukt in mIMCD3 cellen (SI Bijlage, Fig. S8). Ervan uitgaande dat permeabilisatie niet heeft geleid tot verlies van essentiële componenten van de GPCR signalering machines, de kleine maar detecteerbare verandering na forskolin toevoeging suggereert dat het mogelijk moet zijn geweest om GPCR-afhankelijke cAMP signalen op te lossen waren ze te laten plaatsvinden in het cilium. Deze gegevens geven ook aan dat de ciliaire membraan van mIMCD3 cellen intact werd gelaten na digitonine behandeling.
De voorgaande gegevens laten ons achter met de vraag waarom GPCR’s niet in staat zijn om cAMP te produceren, eenmaal afgezonderd in het cilium. Eerdere studies hebben Ca2+ toegang door het ciliaire membraan genoemd als een belangrijke regulator van organel cAMP door de aanwezigheid van cilia-specifieke Ca2+-geleidende kanalen (PKD2L1 en PKD2) en Ca2+-gereguleerde AC’s (AC1, 8, 5, en 6) (11, 16, 23, 32, 37). Van primaire cilia van mIMCD3 cellen is bekend dat ze Ca2+-inhibeerbare AC5 en/of AC6 herbergen (10). We hebben daarom overwogen dat de hoge rust en Ca 2 + permeabiliteit van het cilium (38, 39) zou kunnen verklaren voor de inactivering van AC’s gekoppeld aan de 5-HT6 receptor. Om dit punt beter aan te pakken, verbeterden we de sensor door de Arl13b targeting sequentie te vervangen door een functionele 5-HT6 receptor om de cAMP reporter-GPCR fusie direct naar het cilium (5-HT6-EpacH187) te richten. In overeenstemming met de gegevens van Figs. 3I en 4C, wanneer uitsluitend gericht op het cilium, 5-HT niet een meetbare cAMP signaal (Fig. 5A). Blootstelling van cellen aan nominaal Ca 2 + vrije oplossingen niet redden van de 5-HT respons in cilia (Fig. 5B), wat aangeeft dat Ca 2 + ingang over de ciliaire membraan niet het signaal te onderdrukken. We overwogen dat misschien expressie van 5-HT6 de ciliaire verdeling van het Gαs eiwit in mIMCD3 cellen veranderde, maar immunokleuring experimenten suggereerden dat dit niet het geval is (SI Appendix, Fig. S9). Echter, toen we het effect van 5-HT getest in cellen voorbehandeld met SAG (250 nM tot 1 µM) om Smo receptoren te activeren (40), waren we in staat om de responsiviteit van de 5-HT6 receptor op agonist (Fig. 5C) te herstellen. Gevoeligheid voor de inverse agonist was ook duidelijk, wat wijst op herstel van constitutieve activiteit (Fig. 5D).
Hedgehog pathway activering verhoogt cAMP respons gerapporteerd door 5-HT6-Epac-H187 op 5-HT en dopamine in primaire cilia: (A) In overeenstemming met de gegevens in Figs. 3I en 4C, reageerden mIMCD3 cellen niet op 10 µM 5-HT wanneer de sensor/receptor fusie strikt beperkt was tot het ciliaire membraan (6 experimenten, 6 cilia). (B) Verzwakking van de hoge in cilia door het plaatsen van cellen in een nominaal Ca 2 + vrije oplossing niet 5-HT-gestimuleerde cAMP signalering (5 experimenten, 6 cilia) te redden. (C) Na overnight voorbehandeling met 1 µM SAG, 5 van de 6 cilia (6 experimenten) gereageerd op 5-HT stimulatie (**P = 0.000992). (D) Voorbehandeling met 1 µM SAG redde de respons op 1 µM SB742257 (-35,5 ± 11,2% onder baseline ten opzichte van de daaropvolgende cAMP toename opgewekt door 10 µM 5-HT; typisch voor 4 experimenten, 4 cilia). (E) Een cAMP-verhoging in NIH 3T3 cilia (kenmerkend voor 9 experimenten, 11 cilia) werd veroorzaakt door 10 μM 5-HT. (F) Overnachting voorbehandeling met 1 uM SAG significant verhoogd 5-HT respons (**P = 0.00034; 6 experimenten, 7 cilia). Overnachting voorbehandeling met 10 uM cyclopamine (Cyclo) had een verwaarloosbaar effect (8 experimenten, 9 cilia, staafdiagram). (G en H) De 100 nM somatostatine (SST) verzwakt 5-HT respons in cilia harboring SSTR3-GFP met en zonder SAG voorbehandeling (G: 5 experimenten, 6 cilia; H: 2 experimenten, 5 cilia). (I en J) SAG voorbehandeling verhoogde de 10 nM dopamine (DA) respons (I: 4 experimenten, 4 cilia, J: 4 experimenten, 6 cilia, **P = 0,002476). Blauwe lijnen, cellichaam; rode lijnen, cilia. Tijdsbalken: 3 min. De y-as is de 480/535 nm FRET-verhouding. Staafdiagrammen geven de 5-HT of DA respons als percentage van de forskolin/IBMX respons; foutbalken vertegenwoordigen SEM.
De voorgaande resultaten lieten ons met de vraag of de onverwachte SAG-afhankelijke up-regulatie van de 5-HT6 receptor uitgedrukt in mIMCD3 cellen was celtype en / of GPCR specifiek. In tegenstelling tot mIMCD3, stimulatie van 3T3 cellen (Fig. 5E) en MEFs (SI Appendix, Fig. S10A) met 5-HT produceerde een meetbare ratio verandering die echter aanzienlijk werd versterkt na SAG behandeling (Fig. 5F en SI Appendix, Fig. S10B). Interessant is dat de gladde receptor antagonist cyclopamine, waarvan verwacht zou kunnen worden dat deze het tegenovergestelde effect van SAG zou hebben, de 5-HT gestimuleerde cAMP signalering in primaire cilia van 3T3 cellen niet afschafte (staafdiagram, Fig. 5F).
Met behulp van dit systeem waren we ook in staat om het vermogen van een ciliary Gαi-gekoppelde GPCR, SSTR3, om serotonine-gestimuleerde cAMP signalen in het cilium om te keren, te evalueren. Behandeling van 3T3 cellen coexpressie van SSTR3-GFP en 5-HT6-H187 met somatostatine omgekeerd 5-HT reacties terug naar de basislijn binnen 2 min in de aanwezigheid en afwezigheid van SAG behandeling (Fig. 5 G en H), wat duidt op lokale controle van de 5-HT6 functie. We hebben verder getest hoe SAG de activiteit van een andere ciliary Gαs gekoppelde GPCR, de dopamine D1R receptor (5), beïnvloedde. D1R-EGFP werd gecoëxpresseerd met 5-HT6-H187 in 3T3 cellen, en cellen met fluorescentie alleen in cilia werden geselecteerd. Tien nanomolaire dopamine produceerde kleine maar meetbare cAMP signalen in controle cellen (Fig. 5I), en opnieuw, het signaal werd aanzienlijk versterkt na SAG behandeling (Fig. 5J; samengevat in staafdiagram).