Free Press

By G.P. ThomasApr 15 2013

Image Credits: khawfangenvi16/.com

High-performance liquid chromatography of hoge-druk vloeistofchromatografie (HPLC) is een chromatografische methode die wordt gebruikt om een mengsel van verbindingen in de analytische chemie en biochemie te scheiden om de afzonderlijke componenten van het mengsel te identificeren, kwantificeren of zuiveren.

Reversed-phase HPLC of Ultra-high Performance Liquid Chromatography (UHPLC) is een veelgebruikte scheidingsmethode. Het zorgt voor dynamische retentie van verbindingen met hydrofobe en organische functionaliteit. Een combinatie van hydrofobe en van der Waals type interacties tussen alle doelverbinding en zowel de stationaire als de mobiele fase maakt de retentie van deze verbindingen door omgekeerde fase mogelijk.

Hoe werkt HPLC?

In zeer kleine hoeveelheden wordt het te scheiden en te testen monstermengsel in een stroom van mobiele fase gestuurd die via een kolom sijpelt. Er zijn verschillende soorten kolommen beschikbaar met sorbentia met verschillende deeltjesgrootte en oppervlak.

Het mengsel beweegt zich met verschillende snelheden door de kolom en treedt in wisselwerking met het sorbent, ook wel de stationaire fase genoemd. De snelheid van elke component in het mengsel is afhankelijk van 1) de chemische aard, 2) de aard van de kolom en 3) de samenstelling van de mobiele fase. Het tijdstip waarop een specifieke analyt uit de kolom komt, wordt de retentietijd genoemd. De retentietijd wordt onder specifieke omstandigheden gemeten en beschouwd als het identificerende kenmerk van een bepaalde analyt.

Sorbensdeeltjes kunnen hydrofoob of polair van aard zijn. Tot de meest gebruikte mobiele fasen behoren een mengbare combinatie van water en organische oplosmiddelen zoals acetonitril en methanol. Ook watervrije mobiele fasen kunnen worden gebruikt.

De waterige component van de mobiele fase kan zuren zoals mierenzuur, fosforzuur of trifluorazijnzuur of zouten bevatten om de scheiding van de monstercomponenten mogelijk te maken. De samenstelling van de mobiele fase wordt tijdens de chromatografische analyse constant gehouden of gevarieerd. De constante benadering is doeltreffend voor de scheiding van de monsterbestanddelen die qua affiniteit voor de stationaire fase niet sterk van elkaar verschillen. Bij de gevarieerde aanpak varieert de samenstelling van de mobiele fase van een lage tot een hoge elutiesterkte. De elutiesterkte van de mobiele fase komt tot uiting in de retentietijd van de analyt, waarbij een hoge elutiesterkte tot een snelle elutie leidt.

De samenstelling van de mobiele fase wordt gekozen op basis van de intensiteit van de interacties tussen verschillende monstercomponenten en de stationaire fase.

Het HPLC-partitioneringsproces lijkt veel op het vloeistof-vloeistofextractieproces, behalve dat het eerstgenoemde een continu proces is, in tegenstelling tot het laatstgenoemde, dat een stapsgewijs proces is. Het verdient aanbeveling proefpartitioneringsprocessen uit te voeren om de exacte HPLC-methode te bepalen die een adequate scheiding zou opleveren.

Fabrikanten van HPLC-systemen

Er is tegenwoordig een breed scala van HPLC-opties op de markt. Hieronder volgt een lijst van verschillende producenten van HPLC-systemen met een korte introductie van hun producten:

• Dionex, een bedrijf dat is gebaseerd op de wetenschap van de chromatografie, produceert het UltiMate® 3000 Rapid Separation LC-systeem, het UltiMate 3000 RSLCnano-systeem, en de Corona®-familie van universeel geladen aerosoldetectoren.
• Jasco Analytical Instruments biedt een reeks HPLC-systemen aan. De LC-2000 Plus Serie HPLC Systemen is uniek configureerbaar. Met hoge prestaties en lage kosten kunnen deze HPLC-systemen worden aangepast aan vrijwel elke behoefte, van eenvoudige isocratische QA tot geavanceerde multi-solvent/multi-kolom methodeontwikkeling. De isocratische LC-2000plus-Iso is voorzien van een pomp, ontgasser, autosampler en UV/Vis detector. De pomp is ontworpen voor debieten van 1 µL tot 10 mL/min bij drukken tot 500 bar voor gebruik met kolommen van 2, 3, 4, 6 en tot 10 mm ID. De Binary Gradient LC-2000plus-HPG is vergelijkbaar met het isocratische systeem, maar is voorzien van een pompconfiguratie met een gradiënt in twee oplosmiddelen. De stroomsnelheden van de pomp zijn compatibel met kolommen van 1 mm. Het quaternaire gradiënt LC-2000plus-LPG is eveneens vergelijkbaar met het isocratische systeem; dit model is echter voorzien van een quaternaire gradiëntpompconfiguratie voor een maximale oplosmiddelflexibiliteit.
• Het Preparatief HPLC-systeem van Gilson heeft een breed debietbereik dat kan worden aangepast voor zowel semi-preparatieve als preparatieve scheidingen. De hoge pompkracht maakt een breed scala aan preparatieve kolomafmetingen mogelijk. Het systeem is ontworpen met een nieuw spoelstationsysteem dat een stromende jetwash omvat en het gebruik van maximaal twee verschillende spoelvloeistoffen mogelijk maakt.
• Sharp™ HPLC-systemen van AAPPTec zijn voorzien van pompen die microprocessorgestuurd zijn, waardoor zeer nauwkeurige en zeer nauwkeurige debieten mogelijk zijn, wat kan helpen bij het verkrijgen van een uitstekende analytische reproduceerbaarheid en de hoogste meetnauwkeurigheid.

Andere fabrikanten op de huidige markt zijn Agilent, Beckman Coulter, Bio-Rad en Buck Scientific.

Voordelen van HPLC

De belangrijkste voordelen van HPLC-systemen zijn als volgt:

• Controleert en automatiseert chromatografie-instrumentatie
• Voorziet in gegevensbeheer, beveiligingsfuncties, en rapportage en instrumentvalidatie.
• Krachtig en aanpasbaar
• Verhoogt de productiviteit door het beheer van alle gebieden van de analyse – van monster tot instrument, en van scheiding tot rapportage van de resultaten.
• Betaalbaar

Toepassingen van HPLC

Het belangrijkste doel van de HPLC techniek is het identificeren, kwantificeren en zuiveren van een bepaalde analyt of verbinding. Er kunnen zowel kwantitatieve als kwalitatieve analyses worden uitgevoerd. HPLC’s kunnen voor de volgende toepassingen worden gebruikt:

• Waterzuivering
• Opsporing van onzuiverheden in de farmaceutische industrie
• Voorconcentratie van sporencomponenten
• Ligand-uitwisselingschromatografie
• Ion-uitwisselingschromatografie van eiwitten
• Hoge-pH anion-uitwisselingschromatografie van koolhydraten en oligosacchariden

Bronnen en verdere lectuur

• Reversed Phase HPLC/UHPLC Chromatografie-Phenomenex
• Dionex Producten-Dionex
• HPLC Systemen-aapptec
• Preparatief HPLC Systeem-Gilson

Dit artikel is bijgewerkt op 22 april, 2019.

Geschreven door

G.P. Thomas

Gary is afgestudeerd aan de Universiteit van Manchester met een eerstegraads graad in Geochemie en een Masters in Aardwetenschappen. Na in de Australische mijnindustrie te hebben gewerkt, besloot Gary zijn geologielaarzen aan de wilgen te hangen en zich op het schrijven te richten. Als hij niet bezig is met het ontwikkelen van actuele en informatieve content, is Gary meestal te vinden terwijl hij zijn geliefde gitaar bespeelt, of toekijkt hoe Aston Villa FC een nederlaag uit de kaken van de overwinning grist.

Citaties

Gebruik een van de volgende formats om dit artikel in uw essay, paper of verslag te citeren:

• APA

  Thomas, G.P.. (2019, 15 augustus). High Performance Liquid Chromatography (HPLC) – Methoden, voordelen en toepassingen. AZoM. Retrieved on March 24, 2021 from https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=8468.

• MLA

  Thomas, G.P.. “High Performance Liquid Chromatography (HPLC) – Methoden, voordelen en toepassingen”. AZoM. 24 maart 2021. <https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=8468>.

• Chicago

  Thomas, G.P.. “High Performance Liquid Chromatography (HPLC) – Methoden, voordelen en toepassingen”. AZoM. https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=8468. (accessed March 24, 2021).

• Harvard

  Thomas, G.P.. 2019. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) – Methoden, voordelen en toepassingen. AZoM, bekeken 24 maart 2021, https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=8468.

.