Free Press

Resultaten en discussie

Conjugatie van Spirogyra wordt naar verluidt geïnduceerd door verlaging van het stikstofgehalte of door uitputting (Grote 1977; Yamashita en Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Daarom hebben we eerst geprobeerd conjugatie te induceren door stikstof uit het kweekmedium te halen. Dit was echter niet succesvol. Grote (1977) rapporteerde dat conjugatie werd geïnduceerd in zuiver anorganisch closteriummedium en dat de pH-waarde belangrijk was. Hoewel wij de algenfilamenten incubeerden in het medium met verschillende pH-waarden, werd conjugatie niet geïnduceerd. Bovendien waren andere proeven, verschillende temperaturen en uitputting van verschillende voedingsstoffen, niet succesvol. Bij sommige soorten Spirogyra werd conjugatie geïnduceerd door algenfilamenten te incuberen onder continue verlichting (Yamashita en Sasaki 1979). Ons materiaal vertoonde echter geen conjugatie, zelfs niet wanneer de filamenten zonder stikstofbron werden geïncubeerd bij continue belichting gedurende 2 weken. Na bovenvermelde verschillende proeven, slaagden we er uiteindelijk in conjugatie te induceren door filamenten te incuberen op een agarplaat bereid met APW bij 23°C onder een 12:12 L-D cyclus gedurende 4 dagen. Tijdens de incubatie werd ook staafvormige rhizoïde gevormd aan het distale einde van de eindcellen. Wanneer de filamenten op de agarplaat in het donker werden geïncubeerd, werd het conjugatiefenomeen niet geïnduceerd. Allen (1958) heeft gerapporteerd dat conjugatie werd geïnduceerd door incubatie op een agarplaat. Zij hield een stockcultuur met Pringsheim’s grond-water medium (Pringsheim 1946) onder een 16 uur licht (koelwitte fluorescentiebuis)-8 uur donker regime bij ongeveer 20°C. Voor de paringsinductie werden enkele filamenten overgebracht op 1,5% Difco-agar, bereid met gedestilleerd water, en geïncubeerd bij ongeveer 20°C onder een L-D-cyclus van 16:8 uur. Na incubatie gedurende enkele dagen werden zygosporen gevormd op de agarplaat. Hoewel de lichtomstandigheden en de temperatuur tijdens de incubatie verschillend waren, was de methode van Allen (1958) fundamenteel dezelfde als onze methode. We analyseerden verder de factoren die verantwoordelijk zijn voor de inductie van conjugatie op de agarplaat, en wel als volgt.

We vroegen ons af of een of andere onbekende contaminant(en) in het agarpoeder verantwoordelijk was (waren) voor de inductie van conjugatie. We onderzochten deze mogelijkheid met het volgende experiment. Agarpoeder (Wako, Osaka, Japan) werd gesuspendeerd in APW en onder roeren een nacht bij 4°C gehouden. Na centrifugatie (185×g, 10 min) werd de resulterende pellet door centrifugatie 2 maal gewassen met APW. De agarpellet werd gesuspendeerd in vers APW en de platen werden bereid. Conjugatie werd met succes geïnduceerd op deze agarplaat. Wanneer algenfilamenten werden geïncubeerd in het supernatant dat werd verkregen door het wassen van agarpoeder, werd conjugatie helemaal niet geïnduceerd (gegevens niet aangetoond). Dus was de incubatie op de agarplaat verantwoordelijk voor de inductie van conjugatie en niet de oplosbare contaminant.

Omdat APW geen stikstofhoudende chemicaliën bevatte, zou de agarplaat geen of zeer weinig stikstof moeten bevatten. Daarom was het mogelijk dat beide factoren, de plaats op de agarplaat en de uitputting van stikstof, synergetisch werkten bij de inductie. Om deze mogelijkheid te onderzoeken, incubeerden we filamenten op een agarplaat bereid met APW aangevuld met 1 mM KNO3. Ook op deze agarplaat werd conjugatie geïnduceerd (Fig. 1a), wat erop wijst dat stikstofdepletie niet verantwoordelijk is voor de inductie van conjugatie. Bovendien werd conjugatie geïnduceerd wanneer filamenten werden geïncubeerd op een agarplaat bereid met closteriummedium, dat verschillende voedingsstoffen bevatte (Fig. 1b). Deze resultaten tonen ondubbelzinnig aan dat de locatie op de agarplaat op zich een factor is die verantwoordelijk is voor de inductie van conjugatie.

Inductie van conjugatie op agarplaat werd onderzocht bij een andere soort, S.fuluviatilis, die rhizoïde differentieerde bij het doorsnijden van de algenfilamenten (gegevens niet weergegeven) zoals in het geval van S. castanacea. Bij deze soort werd conjugatie ook geïnduceerd na incubatie op een agarplaat bereid met APW. We onderzochten verder de conjugatie op agarplaten bij drie Spirogyra, die geen rhizoïden onderscheidden. S.ellipsospora Transeau is in het laboratorium in stand gehouden als contaminant van Chara-cultuur. De andere twee Spirogyra sp. verzameld uit het Biwa-meer werden gedurende 6 maanden als axenische cultuur in stand gehouden. Alle drie Spirogyra vertoonden geen conjugatie bij incubatie op een agarplaat.

In sommige Spirogyra-soorten werd conjugatie geïnduceerd door verlaging of verlaging van het stikstofgehalte (Grote 1977; Yamashita en Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Naast het stikstofgehalte moesten bij S. majuscule ook de lichtintensiteit en/of de pH worden gecontroleerd (Grote 1977). Bij S. castanacea en S. fuluviatilis was incubatie op de agarplaat doeltreffend en was uitputting van stikstof niet nodig (onderhavige studie). Anderzijds meldden Agrawal en Singh (2002) dat Spirogyra sp. niet begon te conjugeren op 2-10% agar plaat. Dit was vergelijkbaar met onze resultaten verkregen bij Spirogyra sp., die geen rhizoïde differentieerde. De factoren die nodig zijn voor de inductie van conjugatie zijn dus sterk variabel tussen de Spirogyra soorten. We vroegen ons af of groeiremming verantwoordelijk was voor de inductie van conjugatie op de agarplaat. Tijdens incubatie op een agarplaat bereid met APW of closterium medium, prolifereerden de cellen via celdeling op beide agarplaten terwijl de cellen niet begonnen met de vorming van de papil van de conjugatiebuis. Dus, remming van de groei was geen trigger van conjugatie.

Om de aanwezigheid van paringstype tussen filamenten te onderzoeken, werd monokweek van S. castanacea onderworpen aan inductie van conjugatie. Na 48 uur incubatie werden twee soorten conjugatie aangetroffen in hetzelfde filament (Fig. 2a-c). Figuur 2b toont cellen geïnduceerde scalariforme conjugatie (pijlpunt in Fig. 2a). Anderzijds, Fig. 2c toont cellen geïnduceerde laterale conjugatie (pijl in Fig. 2a). Zygosporen werden normaal gevormd na de laterale conjugatie (Fig. 2d). Yamagishi (1977) rapporteerde dat de scalariforme conjugatie algemeen wordt waargenomen, terwijl de laterale zelden werd waargenomen bij S.castanacea. Ons resultaat was consistent met dat van Yamagishi (1977). Echter, binnen de grenzen van onze kennis, is de inductie van zowel scalaire als laterale conjugatie in eenzelfde filament (Fig. 2a) het eerste verslag. Wanneer twee filamenten paarsgewijs verbonden werden, gedroegen alle cellen van het ene filament zich als mannelijk en die van het andere filament als vrouwelijk in de meeste gevallen. In zeer zeldzame gevallen werden echter zygosporen gevormd in beide filamenten (Fig. 3). Het paringstype ligt dus niet vast, althans niet bij S. castanacea. Hypnozygote werden gevormd door incubatie op de agarplaat gedurende ongeveer 1 maand. Het was echter moeilijk om reproduceerbare ontkieming te induceren door er closterium medium aan toe te voegen. Er moet een methode worden gevonden om kieming op reproduceerbare wijze te induceren.

We onderzochten de identificatie van extracellulaire materialen die tijdens het paringsproces worden uitgescheiden met behulp van diverse lectines in S. castanacea. Van de 19 onderzochte lectines (BSL-I, BSL-II, Con A, DBA, DSL, ECL, jacalin, LEL, PHA-E, PHA-L, PNA, PSA, RCA I, SBA, SJA, STL, UEA I, VVL en WGA) kleurden BSL-1, Con A, jacalin, RCA-I en SBA voortplantingscellen, maar geen vegetatieve cellen (tabel 1). Yoon et al. (2009) rapporteerden dat drie lectines, Con A, RCA en UEA, aanzienlijke labeling vertoonden op extracellulaire materialen in S. varians (Hassall) Kützing. De lectine-bindende materialen die tijdens de conjugatie worden uitgescheiden, lijken dus tot op zekere hoogte te verschillen van soort tot soort. Wij rapporteerden eerder dat BSL-I en jacaline contrasterende kleurpatronen vertoonden in rhizoïd: jacaline kleurde duidelijk de omtrek van rhizoïd, terwijl de kleuring met BSL-I diffuus was (Inoue et al. 1999, Ikegaya et al. 2008b). Er werd gesuggereerd dat het BSL-I-bindende materiaal verantwoordelijk was voor de adhesie van de filamenten aan het substraat. Anderzijds werd gespeculeerd dat het jacalin-bindende materiaal betrokken was bij de herkenning van het substraat (Ikegaya et al. 2008b). In de huidige studie hebben we onze aandacht daarom gericht op BSL-I en jacalin (Fig. 4). Na 48 uur incubatie op een agarplaat vormde een filament, afgebeeld in Fig. 4a, papillen in verschillende richtingen. Er werd gespeculeerd dat dit filament de vorming van papillen startte in afwezigheid van het partnerdraad. BSL-I kleurde het oppervlak van de papillen sterk. De scheidingen tussen de cellen waren ook sterk gekleurd. Vervolgens kleurden we een paar filamenten die na 48 uur incubatie begonnen te conjugeren. In Fig. 4b werd vastgesteld dat het bovenste filament een mannelijke gameet was en het onderste een vrouwelijke gameet, aangezien de diameter van de onderste cellen van het filament groter werd dan die van het bovenste filament. Conjugatiebuisjes die uit gepaarde cellen voortkwamen, waren sterk gekleurd, terwijl het hele celoppervlak van de vrouwelijke gameet zwak gekleurd was (Fig. 4b′). Na 72 uur incubatie was het hele celoppervlak van de mannelijke gameet ook zwak gekleurd (Fig. 4c′). Na 96 uur incubatie op een agarplaat werden zygosporen gevormd (Fig. 4d). De conjugatiebuisjes waren sterk gekleurd (Fig. 4d′), terwijl het oppervlak van de zygosporen niet gekleurd was. Vervolgens werd de kleuring met jacaline onderzocht. Cellen van filamenten in Fig. 3e vormden papillen in dezelfde richting. We speculeerden dat dit filament de conjugatie startte in de aanwezigheid van een partnerdraad en dat het verloren ging tijdens de overdracht op het objectglaasje. Papillae waren sterk gekleurd met jacaline (Fig. 4e′). Tijdens het hele conjugatieproces kleurde jacaline vooral de conjugatiekanalen (Fig. 4f′-h′). Het kleuringpatroon met Con A, RCA-I en SBA werd ook onderzocht (gegevens niet getoond). Con A kleurde sterk de septa tussen de zygospore gevormd in vrouwelijke gameet, terwijl de papillen zeer zwak gekleurd waren. Wanneer zygosporen werden gevormd, was het patroon van kleuring met RCA-I of SBA vergelijkbaar met dat van BSL-I, zoals blijkt uit fig. 4d′.

Wij onderzoeken het effect van zes lectines, BSL-I, Con A, jacalin, RCA-I, SBA, en WGA, op conjugatie. Filamenten werden gedurende 1 dag voorgeïncubeerd in APW aangevuld met één van beide lectines. Daarna werden ze overgebracht op een agarplaat waaraan hetzelfde lectine was toegevoegd en gedurende 4 dagen geïncubeerd. Het bleek dat jacalin de vorming van zygospore sterk remde, maar de andere niet (gegevens niet aangetoond). Systematische analyse toonde aan dat jacalin de stap van het prille begin, het begin van de papilvorming, sterk remde (Fig. 5). Vervolgens werd de omkeerbaarheid van de remming door jacalin onderzocht. Filamenten werden achtereenvolgens geïncubeerd in APW aangevuld met jacalin gedurende 1 dag en vervolgens in APW zonder jacalin gedurende 1 dag. Daarna werden ze gedurende 4 dagen geïncubeerd op een agarplaat zonder jacalin. Er werden echter helemaal geen papillen gevormd. Deze onomkeerbare remming zou veroorzaakt kunnen worden door de sterke binding van jacalin. Yoon et al. (2009) meldden dat RCA en UEA de conjugatie remden. Zij identificeerden echter niet de stap van de remming. Hoewel BSL-I, RCA-I, Con A en SBA ook de conjugatiebuis kleurden, remden zij de vorming ervan niet af. De rol van de materialen die door BSL-I, RCA-I of SBA worden herkend, is het doel van toekomstige studies.

Randhawa (1959) suggereerde een overeenkomst tussen de conjugatieprocessen en de vorming van rhizoïden: er is een contactprikkel bij betrokken. Anderzijds meende Kniep (1928) dat de conjugatieprocessen hoofdzakelijk het gevolg waren van een chemische stimulus (geciteerd in Randhawa (1959)). Zowel de conjugatiebuis als het rhizoide beginnen via de vorming van papillen en kunnen zich verlengen via tipgroei. De conjugatiebuis wordt echter gevormd aan de flank, maar het rhizoide wordt gevormd aan het distale einde van de cel (Nagata 1973). Jacalin kleurde duidelijk de omtrek van zowel conjugatiebuis (Fig. 3e′-h′) als rhizoïde (Ikegaya et al. 2008b). Jacalin remde de vorming van rhizoïden niet, maar remde wel de differentiatie tot rozetvormige rhizoïden (Ikegaya et al. 2008b). In het geval van conjugatiebuizen remde jacalin echter de vorming van papil op zich (Fig. 5). Het lijkt erop dat de rol van jacalin-bindend materiaal verschillend is in conjugatiebuis en rhizoïde.

Succes in reproduceerbare inductie van conjugatie in het laboratorium opende een weg voor systematische analyses van conjugatie in Spirogyra, zoals bepaling mechanisme van seksualiteit van cellen, rol van lectine-bindend materiaal, bewegingsmechanisme van mannelijke protoplast.