Bij de overgrote meerderheid van de IHC/ICC-procedures worden weefsels en cellen gefixeerd met fixeermiddelen op basis van formaldehyde. Het onderstaande protocol beschrijft de techniek voor het genereren van een 4% formaldehyde-oplossing in PBS. Het meest effectieve fixatief moet experimenteel worden bepaald.
Voorzichtigheid: Formaldehyde is giftig. Lees het MSDS voordat u met deze chemische stof gaat werken. Handschoenen en veiligheidsbril dragen en oplossingen maken in een zuurkast.
Het protocol in zijn geheel lezen alvorens te beginnen.
Vereiste reagentia
- Geïoniseerd H2O
- HCl (verdund)
- NaOH (1 N)
- Paraformaldehyde poeder
- 1X PBS: 0,145 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0081 M Na2HPO4, 0,0015 M KH2PO4, pH 7.4
Materialen
- Filtreereenheden
- Glaswerk en roerstaaf (speciaal voor formaldehyde-oplossing)
- Handschoenen en oogbescherming
- Warmhoudplaat met magneetroerder
- Thermometer
- Geventileerde kap
Procedure
- Voor 1 L van 4% formaldehyde, Voeg 800 mL 1X PBS toe aan een glazen bekerglas op een roerplaat in een geventileerde kap. Verwarm al roerend tot ongeveer 60 °C. Zorg ervoor dat de oplossing niet kookt.
- Voeg 40 g paraformaldehydepoeder toe aan de verwarmde PBS-oplossing.
- Het poeder zal niet onmiddellijk in de oplossing oplossen. Verhoog de pH langzaam door druppelsgewijs 1 N NaOH uit een pipet toe te voegen tot de oplossing helder wordt.
- Als het paraformaldehyde is opgelost, moet de oplossing worden afgekoeld en gefiltreerd.
- Haal het volume van de oplossing op 1 L met 1X PBS.
- Controleer de pH, en breng deze met kleine hoeveelheden verdund HCl op ongeveer 6.9.
- De oplossing kan in aliquot worden gegeven en bij 2-8 °C worden ingevroren of maximaal een maand worden bewaard.
Het verschil tussen paraformaldehyde, formaldehyde en formaline
Paraformaldehyde (chemische naam is polyoxymethyleen) is een poeder van gepolymeriseerd formaldehyde dat op zichzelf geen weefsels kan fixeren. Om als weefselfixeermiddel te kunnen worden gebruikt, moet paraformaldehyde in heet water worden opgelost om een formaldehydeoplossing te worden. Formalin is een verzadigde formaldehyde-oplossing in water (37% in gewicht, 40% in volume) met 10-15% methanol. Methanol wordt toegevoegd om de polymerisatie tot formaldehyde te vertragen, waardoor het fixeervermogen van formaline afneemt. Formaline kan ook in alcoholvrije vorm worden gemaakt van paraformaldehyde in poedervorm.