Sunteți la aeroport și pierdeți timpul cu un raport care trebuie predat mâine dimineață profesorului dumneavoastră. Aveți datele dumneavoastră. De ce să nu profitați de timp și să calculați variația de expresie fold change pentru genele pe care le-ați testat în acel prim experiment qPCR pe care l-ați făcut săptămâna trecută?
Este ușor – vă voi arăta cum.
Verificați-vă metoda
Există două modalități principale de a analiza datele qPCR: analiza dublu delta Ct și metoda curbei standard relative (metoda Pfaffl). Ambele metode fac presupuneri și au limitările lor, astfel încât metoda pe care ar trebui să o folosiți pentru analiza dvs. va depinde de proiectul dvs. experimental.
Analiza dublu delta Ct presupune că:
- există o eficiență egală a amorselor între seturile de amorsă (de ex. în limita a 5%);
- există o eficacitate de amplificare de aproape 100% a genelor de referință și a genelor țintă;
- genele de control intern sunt exprimate în mod constant și nu sunt afectate de tratament.
Metoda se adresează, în general, experimentelor cu un număr mare de probe de ADN și un număr redus de gene care trebuie testate.
Metoda curbei standard relative presupune că:
- există eficiențe egale între probele de control și cele tratate.
Această metodă funcționează mai bine dacă aveți mai puține probe de ADN, dar un număr mai mare de gene de testat.
De ce aveți nevoie pentru analiza Ct dublu delta
- valorile CtqPCR (date brute) pentru:
- gena housekeeping: condiții de control și experimentale;
- gena de interes: condiții de control și experimentale;
- O foaie de calcul Excel.
Și asta e tot! Nu este nevoie de software costisitor.
Iată un scurt rezumat al principalelor etape ale analizei dublu delta Ct (pentru o explicație detaliată citiți această lucrare).
4 Etape pentru analiza dublu delta Ct
1. Luați media valorilor Ct pentru gena housekeeping și gena care se testează în condițiile experimentale și de control, obținând 4 valori. Cele 4 valori sunt: gena testată experimental (TE), gena testată control (TC), gena de menținere a casei experimentală (HE) și gena de menținere a casei control (HC).
| Valoare Ct medie experimentală | Valoare Ct medie experimentală | Valoare Ct medie de control | Valoare Ct medie de control | Valoare Ct medie de control | \DeltaCt Value (Experimental) | \DeltaCt Value (Control) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| TE | HE | TC | HC | \DeltaCTE | \DeltaCTC | |
| 21.27 | 20,23 | 19,60 | 19,27 | 1,03 | 0,33 |
2. Calculați diferențele dintre valorile experimentale (TE – HE) și cele de control (TC – HC). Acestea sunt valorile \DeltaCt pentru condițiile experimentale (\DeltaCTE) și, respectiv, de control (\DeltaCTC).
3. Apoi, calculați diferența dintre valorile \DeltaCT pentru condițiile experimentale și de control (\DeltaCTE – \DeltaCTC) pentru a ajunge la valoarea delta Ct dublă (ddCt).
4. Deoarece toate calculele sunt în baza logaritmică 2, de fiecare dată când există de două ori mai mult ADN, valorile Ct scad cu 1 și nu se vor înjumătăți. Trebuie să calculați valoarea de 2^{-2\-2\Delta\Delta C_{t}} pentru a obține expresia fold change.
| dCt Value (Experimental) | dCt Value (Control) | dCt Value (Control) | ddCt Value | Expression Fold Change |
|---|---|---|---|---|
| dCTE | dCTC | ddCt | ddCt | 2^-ddCt |
| 1.03 | 0,33 | 0,70 | 0,615572207 |
Ce înseamnă valoarea?
Acum că aveți valoarea pentru schimbarea de pliu, ce înseamnă de fapt? Această valoare este schimbarea fold a genei dvs. de interes în condiția de testare, în raport cu condiția de control, care a fost toată normalizată la gena dvs. de menținere.
Pentru a face acest lucru un pic mai clar – vă puteți gândi la ea ca la un procent. O schimbare fold de 1 înseamnă că există 100% la fel de multă expresie a genei în condiția dvs. de testare ca și în condiția de control – deci nu există nicio schimbare între grupul experimental și grupul de control. O valoare a schimbării fold-change de peste 1 arată o creștere a expresiei genei de interes în raport cu martorul (o schimbare de 1,2 ori = 120% din expresia genei în raport cu martorul, 5 = 500%, 10 = 1.000%, etc.). Valorile sub 1 indică o scădere a expresiei genei în raport cu martorul (o schimbare de fold change de 0,5 reprezintă 50% din expresia genei în raport cu martorul, deci jumătate din expresie față de martor, etc.).
Puteți prezenta aceste date sub formă de diagrame de bare fold-change, reprezentând grafic condițiile de control egale cu 1. De asemenea, puteți folosi analize statistice pentru a verifica semnificația schimbărilor, de exemplu, folosind o analiză a varianței (ANOVA) sau teste t, orice este adecvat pentru configurația dvs. experimentală!
Utilizând acești pași, puteți efectua analiza qPCR oriunde vă aflați, chiar dacă sunteți într-o excursie. Pentru a ușura și mai mult lucrurile, puteți crea un șablon Excel pe care să îl folosiți de fiecare dată. Astfel, nu va trebui decât să introduceți datele și îi veți uimi pe ceilalți cu promptitudinea cu care efectuați analizele!
Publicat inițial la 9 iulie 2016. Revizuit și actualizat la 8 februarie 2021.
Further Reading
Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 2^{-2\Delta\Delta C_{t}}. Method. Metode. 2001;25:402-8.
V-a ajutat acest lucru? Atunci vă rugăm să împărtășiți cu rețeaua dumneavoastră.