Rezultate și discuții
S-a raportat că conjugarea Spirogyra este indusă de scăderea conținutului de azot sau de epuizarea acestuia (Grote 1977; Yamashita și Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Prin urmare, am încercat mai întâi să inducem conjugarea prin epuizarea azotului din mediul de cultură. Totuși, acest lucru nu a avut succes. Grote (1977) a raportat că conjugarea a fost indusă în mediu de closterium anorganic pur și că valoarea pH-ului a fost importantă. Deși am incubat filamentele de alge în mediu cu pH diferit, conjugarea nu a fost indusă. În plus, alte încercări, diferite temperaturi și epuizarea diferitelor substanțe nutritive, nu au avut succes. S-a raportat că conjugarea a fost indusă prin incubarea filamentelor de alge sub iluminare continuă la unele specii de Spirogyra (Yamashita și Sasaki 1979). Cu toate acestea, materialele noastre nu au prezentat conjugare, chiar și atunci când filamentele au fost incubate fără sursă de azot sub iluminare continuă timp de 2 săptămâni. După diferitele încercări menționate mai sus, am reușit în cele din urmă să inducem conjugarea prin incubarea filamentelor pe o placă de agar preparată cu APW la 23°C sub un ciclu L-D de 12:12-h timp de 4 zile. La capătul distal al celulelor terminale s-au format, de asemenea, rizoizi în formă de tijă în timpul incubării. În cazul în care filamentele de pe placa de agar au fost incubate în întuneric, fenomenul de conjugare nu a fost indus. Allen (1958) a raportat că conjugarea a fost indusă prin incubarea pe placa de agar. Ea a menținut o cultură de rezervă folosind mediul sol-apă de Pringsheim (Pringsheim 1946) într-un regim de 16 ore de lumină (tub fluorescent alb rece) și 8 ore de întuneric la aproximativ 20 °C. Pentru inducerea împerecherii, mai multe filamente au fost transferate pe agar Difco 1,5% preparat cu apă distilată și incubate la aproximativ 20°C în cadrul unui ciclu L-D de 16:8 ore. După câteva zile de incubare, s-au format zigozpori pe placa de agar. Deși condițiile de lumină și temperatura din timpul incubării au fost diferite, metoda lui Allen (1958) a fost în esență aceeași cu metoda noastră. Am analizat în continuare factorii responsabili de inducerea conjugării pe placa de agar, după cum urmează.
Ne-am întrebat dacă nu cumva unul sau mai mulți contaminanți necunoscuți conținuți în pulberea de agar erau responsabili de inducerea conjugării. Am examinat această posibilitate prin următorul experiment. Pulberea de agar (Wako, Osaka, Japonia) a fost suspendată în APW și menținută la 4°C sub agitare peste noapte. După centrifugare (185×g, 10 minute), peleta rezultată a fost spălată de 2 ori cu APW prin centrifugare. Celula de agar finală a fost suspendată în APW proaspăt și s-au pregătit plăcile. Conjugarea a fost indusă cu succes pe această placă de agar. Atunci când filamentele de alge au fost incubate în supernatantul obținut prin spălarea pudrei de agar, conjugarea nu a fost deloc indusă (datele nu sunt prezentate). Astfel, incubarea pe placa de agar, dar nu contaminantul solubil, a fost responsabilă pentru inducerea conjugării.
Din moment ce APW nu conținea substanțe chimice azotate, placa de agar ar trebui să nu conțină deloc sau foarte puțin azot. Prin urmare, a fost posibil ca ambii factori, localizarea pe placa de agar și epuizarea azotului, să acționeze sinergic în inducție. Pentru a examina această posibilitate, am incubat filamentele pe placa de agar preparată cu APW suplimentată cu 1 mM KNO3. Pe această placă de agar, conjugarea a fost, de asemenea, indusă (Fig. 1a), ceea ce indică faptul că epuizarea azotului nu este responsabilă pentru inducerea conjugării. În plus, conjugarea a fost indusă atunci când filamentele au fost incubate pe o placă de agar preparată cu mediu closterium, care conținea diverși nutrienți (Fig. 1b). Aceste rezultate au indicat fără echivoc faptul că localizarea pe placa de agar în sine este un factor responsabil pentru inducerea conjugării.
Efectul KNO3 și al mediului closterium asupra începerii conjugării pe placa de agar. Aproximativ 100 de filamente au fost incubate pe plăci de agar pregătite folosind APW, APW suplimentat cu 1 mM KNO3 sau mediu closterium la 23°C sub un ciclu L-D de 12:12 h timp de 4 zile. Când s-a observat papila, am considerat că celula a început conjugarea. Rezultatele au fost prezentate ca raport între numărul de filamente care au început formarea tubului de conjugare și numărul total de filamente. Experimentele au fost repetate de 3 ori, iar datele sunt reprezentate ca medie și eroare standard a mediei (SEM)
Inducția conjugării pe placa de agar a fost examinată și la alte specii, S.fuluviatilis, care a diferențiat rizoidul la tăierea filamentelor de algă (datele nu sunt prezentate), ca și în cazul S. castanacea. La această specie, conjugarea a fost, de asemenea, indusă la incubarea pe placa de agar preparată cu APW. Am examinat în continuare conjugarea pe placa de agar la trei Spirogyra, care nu au diferențiat rizoidul. S.ellipsospora Transeau a fost menținută în laborator ca un contaminant al culturii de Chara. Alte două Spirogyra sp. colectate din lacul Biwa au fost menținute ca cultură axenică timp de 6 luni. Toate cele trei Spirogyra nu au prezentat conjugare prin incubare pe placă de agar.
La unele specii de Spirogyra, conjugarea a fost indusă prin scăderea sau epuizarea conținutului de azot (Grote 1977; Yamashita și Sasaki 1979; Simons et al. 1984). În plus față de conținutul de azot, intensitatea luminii și/sau pH-ul au trebuit să fie controlate la S. majuscule (Grote 1977). La S. castanacea și S.fuluviatilis, incubarea pe placa de agar a fost eficientă și nu a fost necesară epuizarea azotului (prezentul studiu). Pe de altă parte, Agrawal și Singh (2002) au raportat că Spirogyra sp. nu a început conjugarea pe placa de agar 2-10%. Acest lucru a fost similar cu rezultatele noastre obținute la Spirogyra sp. care nu a diferențiat rizoidul. Astfel, factorii necesari pentru inducerea conjugării sunt foarte variabili între speciile de Spirogyra. Ne-am întrebat dacă inhibarea creșterii a fost responsabilă pentru inducerea conjugării pe placa de agar. În timpul incubării pe placa de agar preparată folosind mediul APW sau closterium, celulele au proliferat prin diviziune celulară pe ambele plăci de agar atunci când celulele nu au început formarea papilei tubului de conjugare. Astfel, inhibarea creșterii nu a fost un factor declanșator al conjugării.
Pentru a examina prezența tipului de împerechere între filamente, cultura monoclonală de S. castanacea a fost supusă inducerii conjugării. După 48 h de incubare, s-au constatat două tipuri de conjugare în același filament (Fig. 2a-c). Figura 2b arată conjugarea scalariformă indusă de celule (cap de săgeată în Fig. 2a). Pe de altă parte, Fig. 2c arată conjugarea laterală indusă de celule (săgeată în Fig. 2a). Zygosporii s-au format în mod normal după conjugarea laterală (Fig. 2d). Yamagishi (1977) a raportat că conjugarea scalariformă este în general observată, în timp ce conjugarea laterală a fost rar la S.castanacea. Rezultatul nostru a fost în concordanță cu cel al lui Yamagishi (1977). Cu toate acestea, în limita cunoștințelor noastre, inducerea atât a conjugării scalariforme, cât și a celei laterale în același filament (Fig. 2a) este primul raport. Atunci când două filamente s-au împerecheat, toate celulele unui filament s-au comportat ca masculi, iar cele ale celuilalt filament s-au comportat ca femele în majoritatea cazurilor. Cu toate acestea, foarte rar, s-au format zigozpore în ambele filamente (Fig. 3). Astfel, tipul de împerechere nu este fix, cel puțin la S.castanacea. Hipnozigoții s-au format prin incubare pe placa de agar timp de aproximativ 1 lună. Cu toate acestea, a fost dificil să se inducă în mod reproductibil germinația prin adăugarea de mediu closterium la acestea. Trebuie găsită o metodă pentru a induce germinația în mod reproductibil.
Inducția conjugărilor scalariforme și laterale în același filament. a Atât conjugările scalariforme, cât și cele laterale s-au format în același filament după 48 h de incubare. b Mărire mai mare a celulelor care prezintă conjugarea scalariformă în a (cap de săgeată). c Mărire mai mare a celulelor care prezintă conjugarea laterală în a (săgeată). d Zygospori formați prin conjugare laterală după 96 h de incubare. Barele 50 μm
Conjugare în cultura de clone. După 96 h de incubare pe placa de agar, s-au format zigoți. S-au format zigozpori în ambele filamente. Bară 50 μm
Am examinat identificarea materialelor extracelulare secretate în timpul procesului de împerechere cu ajutorul diferitelor lectine la S. castanacea. Dintre cele 19 lectine examinate (BSL-I, BSL-II, Con A, DBA, DBA, DSL, ECL, ECL, jacalin, LEL, PHA-E, PHA-L, PNA, PSA, RCA I, SBA, SJA, STL, UEA I, VVL și WGA), BSL-1, Con A, jacalin, RCA-I și SBA au colorat celulele reproductive, dar nu și celulele vegetative (tabelul 1). Yoon et al. (2009) au raportat că trei lectine, Con A, RCA și UEA, au prezentat o marcare considerabilă a materialelor extracelulare la S. varians (Hassall) Kützing. Astfel, materialele care se leagă de lectine secretate în timpul conjugării par a fi diferite într-o anumită măsură între specii. Am raportat anterior că BSL-I și jacalina au prezentat modele de colorare contrastante în rizoid: jacalina a colorat clar conturul rizoidului, în timp ce colorarea cu BSL-I a fost difuză (Inoue et al. 1999, Ikegaya et al. 2008b). S-a sugerat că materialul care se leagă de BSL-I era responsabil de aderența filamentelor la substrat. Pe de altă parte, s-a speculat că materialul de legare a jacalinei este implicat în recunoașterea substratului (Ikegaya et al. 2008b). În studiul de față, prin urmare, ne-am concentrat atenția asupra BSL-I și jacalin (Fig. 4). După 48 h de incubare pe placa de agar, un filament prezentat în Fig. 4a a format papile în diferite direcții. S-a speculat că acest filament a început formarea papilelor în absența filamentului partener. BSL-I a colorat puternic suprafața papilelor. Septele dintre celule au fost, de asemenea, puternic colorate. În continuare, am colorat o pereche de filamente care au început conjugarea după 48 h de incubare. În Fig. 4b, s-a apreciat că filamentul superior era gameta masculină și, respectiv, că cel inferior era gameta feminină, deoarece diametrul celulelor inferioare ale filamentului devine mai mare decât cele ale filamentului superior. Tuburile de conjugare alungite din celulele împerecheate au fost puternic colorate, în timp ce întreaga suprafață celulară a gameților feminini a fost slab colorată (Fig. 4b′). După 72 de ore de incubare, întreaga suprafață celulară a gameților masculi a fost, de asemenea, slab colorată (Fig. 4c′). După 96 de ore de incubare pe placa de agar, s-au format zigozpori (Fig. 4d). Tubii de conjugare au fost puternic colorați (Fig. 4d′), în timp ce suprafața zigozporilor nu a fost colorată. În continuare, s-a examinat colorarea cu jacalin. Celulele din filamentele din Fig. 3e au format papile în aceeași direcție. Am speculat că acest filament a început conjugarea în prezența unui filament partener și a fost pierdut în timpul transferului pe sticla de lamă. Papilele au fost puternic colorate cu jacalin (Fig. 4e′). Pe parcursul procesului de conjugare, jacalina a colorat în principal canalele de conjugare (Fig. 4f′-h′). A fost examinat, de asemenea, modelul de colorare cu Con A, RCA-I și SBA (datele nu sunt prezentate). Con A a colorat puternic septurile dintre zigozporii formați în gameții feminini, în timp ce papilele au fost foarte slab colorate. Atunci când s-au format zigozporii, modelul de colorare cu RCA-I sau SBA a fost similar cu cel al BSL-I, așa cum se arată în Fig. 4d′.
Tabel 1
Survey of various lectins for binding to vegetative and reproductive cells of Spirogyracastanacea
.
| Lectine | Celule vegetative | Cele de reproducere | Specificitate | |
|---|---|---|---|---|
| BSL-I | × | ○ | Gal α, GalNAc α | |
| Con A | × | ○ | Man α, Glc α | |
| Jacalin | × | ○ | Sialil-Gal β1-3 GalNAc-O- | |
| RCA I | × | ○ | Gal, GalNAc | |
| SBA | × | ○ | GalNAc | |
| WGA | × | × | × | (GlcNAc)n, acid sialic |
Celulele s-au colorat (○), nu s-au colorat deloc (×)
Suspendarea filamentelor în procesul de reproducere sexuală cu BSL-I și jacalin. Filamentele incubate pe placa de agar au fost colorate fie cu BSL-I marcat cu fluoresceină, fie cu jacalin (a′-h′). Sunt prezentate, de asemenea, microfotografii în câmp luminos (a-h). a′-d′ colorare cu BSL-I. După 48 h de incubare pe agar, s-au format papile în diferite direcții (a, a′) sau filamente care au început să se conjuge (b, b′). Filamente conjugate după 72 h de incubare (c, c′). După 96 h de incubare, s-au format zigoți (d, d′). e′-h′ colorare cu jacalin. După 48 h de incubare pe agar, s-au format papile în aceeași direcție (e, e′), sau filamentele au început să se conjuge (f, f′). Filamente conjugate după 72 h de incubare (g, g′). După 96 h de incubare, s-au format zigoți (d, d′). Bară 50 μm
Am examinat efectul a șase lectine, BSL-I, Con A, jacalin, RCA-I, SBA și WGA, asupra conjugării. Filamentele au fost pre-incubate în APW suplimentat cu una dintre lectine timp de 1 zi. Apoi, au fost transferați pe o placă de agar suplimentată cu aceeași lectină și incubați timp de 4 zile. S-a constatat că jacalina a inhibat sever formarea de zigospori, dar nu și celelalte (datele nu sunt prezentate). Analiza sistematică a arătat că jacalina a inhibat sever etapa de început; începutul formării papilelor (Fig. 5). În continuare, a fost examinată reversibilitatea inhibării de către jacalină. Filamentele au fost incubate succesiv în APW suplimentat cu jacalin timp de 1 zi și apoi în APW lipsit de jacalin timp de 1 zi. Apoi, acestea au fost incubate pe o placă de agar lipsită de jacalin timp de 4 zile. Cu toate acestea, papila nu s-a format deloc. Această inhibiție ireversibilă ar putea fi cauzată de legarea puternică a jacalinei. Yoon et al. (2009) au raportat că RCA și UEA au inhibat conjugarea. Cu toate acestea, ei nu au identificat etapa de inhibiție. Deși BSL-I, RCA-I, Con A și SBA au colorat, de asemenea, tubul de conjugare, acestea nu au inhibat formarea acestuia. Rolurile materialelor recunoscute fie de BSL-I, RCA-I sau SBA reprezintă ținta unor studii viitoare.
Efectul lectinelor asupra începerii formării tubului de conjugare. Aproximativ 100 de filamente au fost incubate în APW suplimentat fie cu 1 μg/ml BSL-I, Con A, jacalin, RCA-I, SBA, sau WGA la 23°C sub un ciclu L-D de 12:12 h timp de 1 zi, apoi au fost transferate pe o placă de agar suplimentată cu aceeași lectină și incubate timp de 4 zile. Când s-a observat papila, am considerat că celula a început conjugarea. Rezultatele au fost reprezentate ca raport între numărul de filamente care au început formarea tubului de conjugare și numărul total de filamente. Experimentele au fost repetate de 4 ori, iar datele sunt reprezentate ca medie și SEM
Randhawa (1959) a sugerat similitudinea dintre procesele de conjugare și formarea rizoidelor: este implicat stimulul de contact. Pe de altă parte, Kniep (1928) credea că procesele de conjugare se datorează în mod esențial unui stimul chimic (citat în Randhawa (1959)). Atât tubul de conjugare, cât și rizoidul încep prin formarea papilei și pot fi alungite prin creșterea vârfului. Cu toate acestea, tubul de conjugare se formează la nivelul flancului, dar rizoidul se formează la capătul distal al celulei (Nagata 1973). Jacalin a colorat clar conturul atât al tubului de conjugare (Fig. 3e′-h′), cât și al rizoidului (Ikegaya et al. 2008b). Jacalina nu a inhibat formarea rizoidului, dar a inhibat diferențierea pentru a deveni un rizoid în formă de rozetă (Ikegaya et al. 2008b). Cu toate acestea, în cazul tuburilor de conjugare, jacalina a inhibat formarea papilei în sine (Fig. 5). Se pare că rolul materialului de legare a jacalinei este diferit în tubul de conjugare și în rizoid.
Succesul în inducerea reproductibilă a conjugării în laborator a deschis calea pentru analize sistematice ale conjugării la Spirogyra, cum ar fi mecanismul de determinare a sexualității celulelor, rolul materialelor de legare a lectinei, mecanismul de mișcare a protoplastului masculin.
.