Marea majoritate a procedurilor IHC/ICC utilizează fixarea țesuturilor și a celulelor folosind fixatori pe bază de formaldehidă. Protocolul de mai jos descrie tehnica de generare a unei soluții de formaldehidă 4% în PBS. Cel mai eficient fixator trebuie să fie determinat experimental.
Atenție: Formaldehida este toxică. Vă rugăm să citiți fișa de securitate înainte de a lucra cu această substanță chimică. Trebuie purtate mănuși și ochelari de protecție, iar soluțiile trebuie făcute în interiorul unei hote de fum.
Vă rugăm să citiți protocolul în întregime înainte de a începe.
Reactivi necesari
- H2O dezionizat
- HCl (diluat)
- NaOH (1 N)
- Paraformaldehidă pulbere
- 1X PBS: 0,145 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0081 M Na2HPO4, 0,0015 M KH2PO4, pH 7.4
Materiale
- Unități de filtrare
- Vase de sticlă și bară de agitare (dedicate pentru soluția de formaldehidă)
- Mănuși și protecție pentru ochi
- Placă fierbinte cu agitator magnetic
- Thermometru
- Cagulă ventilată
.
Procedură
- Pentru 1 L de formaldehidă 4%, se adaugă 800 ml de PBS 1X într-un pahar de sticlă pe o placă de agitare într-o hotă ventilată. Se încălzește în timp ce se agită până la aproximativ 60 °C. Aveți grijă ca soluția să nu fiarbă.
- Adaugați 40 g de pulbere de paraformaldehidă la soluția PBS încălzită.
- Pudra nu se va dizolva imediat în soluție. Creșteți încet pH-ul adăugând 1 N NaOH picătură cu picătură dintr-o pipetă până când soluția se limpezește.
- După ce paraformaldehida este dizolvată, soluția trebuie răcită și filtrată.
- Ajustați volumul soluției la 1 L cu 1X PBS.
- Verificați din nou pH-ul și ajustați-l cu cantități mici de HCl diluat la aproximativ 6.9.
- Soluția poate fi alicotată și congelată sau depozitată la 2-8 °C timp de până la o lună.
Diferența dintre paraformaldehidă, formaldehidă și formalină
Paraformaldehida (denumirea chimică este polioximetilenă) este o pulbere de formaldehidă polimerizată care, prin ea însăși, nu poate fixa țesuturile. Pentru a putea fi utilizată ca fixator de țesuturi, paraformaldehida trebuie să fie dizolvată în apă fierbinte pentru a deveni o soluție de formaldehidă. Formalina este o soluție saturată de formaldehidă în apă (37% în greutate, 40% în volum) care conține 10-15% metanol. Metanolul se adaugă pentru a încetini polimerizarea în formaldehidă, ceea ce reduce puterea de fixare a formalinei. Formalina poate fi obținută, de asemenea, într-o formă fără alcool din paraformaldehidă sub formă de pulbere.
.