Rezultate
Imaginea AMPc în ciliul primar al celulelor vii folosind biosenzori fluorescenți prezintă câteva provocări unice. În primul rând, ciliile sunt mici și subțiri, ieșind cu 2-10 µm deasupra suprafeței celulei; în al doilea rând, deși nu sunt mobile, ele sunt supuse mișcării datorită fluxului masiv în soluția de baie și, în al treilea rând, semnalele ciliare de bună credință pot fi dificil de separat optic de fluorescența de fond emanată de corpul celular. Deși au fost descriși anterior mai mulți reporteri de AMPc direcționați către ciliu (19, 24, 25), am încercat să generăm biosenzori ratiometrici cu luminozitate îmbunătățită și fidelitate de direcționare. După ce am testat numeroase modele, am constatat că cea mai bună direcționare, luminozitate și sensibilitate au fost oferite de sondele pe bază de Epac din a patra generație din laboratorul lui Kees Jalink (EpacH188 și o versiune cu o mai mare afinitate, EpacH187) (26) combinate cu Arl13b, o proteină foarte bine localizată în cili (27) (Fig. 1A). Senzorii care încorporează receptorul 5-HT6 au dat o localizare comparabil de bună ca și sondele cuplate cu Arl13b; cu toate acestea, așa cum se discută mai jos, receptorii 5-HT6 care nu sunt localizați la cili au provocat o creștere a AMPc-ului celular datorită activității constitutive bine cunoscute a acestui GPCR (28).
Semnalizarea AMPc în cilia celulelor permeabilizate cu digitonină. Toate experimentele au fost efectuate în tampon de tip intracelular suplimentat cu ATP și GTP. (A) Celulele mIMCD3 care exprimă 5-HT6-mCherry și Arl13b-H187 localizate atât în celulă, cât și în ciliu nu au răspuns la 10 µM 5-HT în corpul celular sau în ciliu după 2 min de tratament cu 20 μg/mL digitonină (4 experimente, 5 cili). (B) În mod similar, capacitatea de răspuns la agonistul invers, 1 µM SB742457, și răspunsul ulterior de revenire la 5-HT6 au fost pierdute atât în celulă, cât și în ciliu după 2 minute de tratament cu 20 μg/mL digitonină (3 experimente, 3 cili). (C) Permeabilizarea cu digitonină a eliminat semnalul cAMP indus de 50 µM forskolin în corpurile celulare, dar creșterea cAMP a fost detectabilă în cili; inhibarea PDE indusă de 1 mM IBMX nu a demascat niciun semnal (n = 4 experimente cu 4 cili/7 celule). (D) Cotransfecția AC3 nu a modificat răspunsul la forskolină. (E) Cuantificarea și compararea răspunsului AMPc la forskolină în corpurile celulare și în cili; **P = 0,0002, ***P = 00019. Urme albastre = corp celular, urme roșii = cili. Barele de timp: 3 min. Axa y este raportul 480/535 nm.
O explicație evidentă pentru lipsa de efect în experimentele precedente a fost că AMPc nu s-a acumulat suficient pentru a fi captat de reporter. Cu toate acestea, atunci când același experiment a fost repetat folosind forskolină pentru a activa direct ACs endogene (adenililciclaze) prezente în membrana ciliară, a fost detectată o acumulare mică, dar consistentă de AMPc în micro-mediul ciliului, dar nu și în corpul celular (Fig. 4 C și E, graficele cu bare din stânga). Rezultate similare au fost obținute în celulele care exprimă AC3 (36) (Fig. 4 D și E, grafice cu bare drepte), care a fost localizat la cili atunci când a fost exprimat în celulele mIMCD3 (Anexa SI, Fig. S8). Presupunând că permeabilizarea nu a dus la pierderea componentelor esențiale ale mașinăriei de semnalizare GPCR, schimbarea mică, dar detectabilă, în urma adăugării de forskolină sugerează că ar fi trebuit să fie posibilă rezolvarea semnalelor cAMP dependente de GPCR dacă acestea ar fi avut loc în ciliu. Aceste date indică, de asemenea, că membrana ciliară a celulelor mIMCD3 a fost lăsată intactă în urma tratamentului cu digitonină.
Datele precedente ne lasă cu întrebarea de ce GPCR-urile nu sunt competente să producă AMPc odată sechestrate în ciliu. Studiile anterioare au citat intrarea Ca2+ prin membrana ciliară ca fiind un regulator important al cAMP din organite datorită prezenței canalelor de conducere a Ca2+ specifice ciliilor (PKD2L1 și PKD2) și a ACs reglementate de Ca2+ (AC1, 8, 5 și 6) (11, 16, 23, 32, 37). S-a raportat că cili primari ai celulelor mIMCD3 adăpostesc AC5 și/sau AC6 inhibitori de Ca2+ (10). Prin urmare, am considerat că permeabilitatea ridicată la repaus și la Ca2+ a ciliului (38, 39) ar putea explica inactivarea AC-urilor cuplate la receptorul 5-HT6. Pentru a aborda mai bine acest aspect, am îmbunătățit senzorul prin înlocuirea secvenței de direcționare Arl13b cu un receptor 5-HT6 funcțional pentru a direcționa fuziunea reporter-GPCR cAMP direct către ciliu (5-HT6-EpacH187). În concordanță cu datele din figurile 3I și 4C, atunci când a fost direcționat exclusiv către ciliu, 5-HT nu a produs un semnal cAMP măsurabil (Fig. 5A). Expunerea celulelor la soluții nominal libere de Ca2+ nu a salvat răspunsul 5-HT în cili (Fig. 5B), ceea ce indică faptul că intrarea Ca2+ prin membrana ciliară nu a suprimat semnalul. Am considerat că, probabil, exprimarea 5-HT6 a alterat distribuția ciliară a proteinei Gαs în celulele mIMCD3, dar experimentele de imunomarcație au sugerat că nu este cazul (Anexa SI, Fig. S9). Cu toate acestea, atunci când am testat efectul 5-HT în celulele pretratate cu SAG (250 nM până la 1 µM) pentru a activa receptorii Smo (40), am reușit să restabilim capacitatea de răspuns a receptorului 5-HT6 la agonist (Fig. 5C). Sensibilitatea la agonistul invers a fost, de asemenea, evidentă, implicând restaurarea activității constitutive (Fig. 5D).
Activarea căii Hedgehog crește răspunsul cAMP raportat de 5-HT6-Epac-H187 la 5-HT și dopamină în cilia primară: (A) În concordanță cu datele din figurile 3I și 4C, celulele mIMCD3 nu au răspuns la 10 µM 5-HT atunci când fuziunea senzor/receptor a fost limitată strict la membrana ciliară (6 experimente, 6 cili). (B) Atenuarea nivelului ridicat în cili prin plasarea celulelor într-o soluție nominal liberă de Ca2+ nu a salvat semnalizarea cAMP stimulată de 5-HT (5 experimente, 6 cili). (C) După pretratarea peste noapte cu 1 µM SAG, 5 din 6 cili (6 experimente) au răspuns la stimularea 5-HT (**P = 0,000992). (D) Pretratarea cu 1 µM SAG a salvat răspunsul la 1 µM SB742257 (-35,5 ± 11,2% sub nivelul de bază în raport cu creșterea ulterioară a AMPc provocată de 10 µM 5-HT; tipic pentru 4 experimente, 4 cili). (E) O creștere a AMPc în cilia NIH 3T3 (tipic pentru 9 experimente, 11 cilia) a fost provocată de 10 μM 5-HT. (F) Pretratarea peste noapte cu 1 μM SAG a crescut semnificativ răspunsul 5-HT (**P = 0,00034; 6 experimente, 7 cili). Pretratarea peste noapte cu 10 μM ciclopamină (Cyclo) a avut un efect neglijabil (8 experimente, 9 cilia, graficul cu bare). (G și H) Somatostatina 100 nM (SST) a atenuat răspunsul 5-HT în cilia care găzduiește SSTR3-GFP cu și fără pretratarea SAG (G: 5 experimente, 6 cilia; H: 2 experimente, 5 cilia). (I și J) Pretratarea SAG a crescut răspunsul la 10 nM dopamină (DA) (I: 4 experimente, 4 cilia, J: 4 experimente, 6 cilia, **P = 0,002476). Urme albastre, corp celular; urme roșii, cili. Barele de timp: 3 min. Axa y este raportul FRET 480/535 nm. Graficele cu bare indică răspunsul 5-HT sau DA ca procent din răspunsul forskolin/IBMX; barele de eroare reprezintă SEM.
Rezultatele precedente ne-au lăsat cu întrebarea dacă reglarea neașteptată, dependentă de SAG, a receptorului 5-HT6 exprimat în celulele mIMCD3 a fost specifică tipului celular și/sau GPCR. Spre deosebire de mIMCD3, stimularea celulelor 3T3 (Fig. 5E) și a MEF-urilor (Anexa SI, Fig. S10A) cu 5-HT a produs o modificare măsurabilă a raportului care a fost, totuși, semnificativ îmbunătățită în urma tratamentului cu SAG (Fig. 5F și Anexa SI, Fig. S10B). În mod interesant, ciclopamina, antagonistul receptorului netezit, care ar putea fi de așteptat să aibă efectul opus al SAG, nu a abolit semnalizarea cAMP stimulată de 5-HT în cilia primară a celulelor 3T3 (graficul cu bare, Fig. 5F).
Utilizând acest sistem, am putut, de asemenea, să evaluăm capacitatea unui GPCR cuplat cu Gαi ciliar, SSTR3, de a inversa semnalele cAMP stimulate de serotonină în ciliu. Tratamentul celulelor 3T3 care coexprimă SSTR3-GFP și 5-HT6-H187 cu somatostatină a inversat răspunsurile 5-HT înapoi la nivelul de bază în 2 min în prezența și absența tratamentului cu SAG (Fig. 5 G și H), indicând un control local al funcției 5-HT6. Apoi am testat în continuare modul în care SAG a afectat activitatea unui alt GPCR cuplat cu Gαs ciliar, receptorul D1R al dopaminei (5). D1R-EGFP a fost coexprimat cu 5-HT6-H187 în celule 3T3, iar celulele cu fluorescență doar în cili au fost selectate. Zece nanomoli de dopamină au produs semnale cAMP mici, dar măsurabile, în celulele de control (Fig. 5I) și, din nou, semnalul a fost semnificativ îmbunătățit după tratamentul cu SAG (Fig. 5J; rezumate în graficul cu bare).
.