Du sitter på flygplatsen och slösar bort tid med en rapport som ska lämnas in till din professor imorgon bitti. Du har dina data. Varför inte utnyttja tiden och beräkna uttryckets fold change för de gener du har testat i det första qPCR-experimentet du gjorde förra veckan?
Det är enkelt – jag ska visa dig hur man gör.
Kontrollera din metod
Det finns två huvudsakliga sätt att analysera qPCR-data: dubbel delta Ct-analys och den relativa standardkurvmetoden (Pfaffl-metoden). Båda metoderna gör antaganden och har sina begränsningar, så vilken metod du ska använda för din analys beror på din experimentella utformning.
Den dubbla delta Ct-analysen förutsätter att:
- Det finns samma primereffektivitet mellan primeruppsättningarna (dvs. inom 5 %);
- det finns en nära 100 % amplifieringseffektivitet för referens- och målgenerna;
- de interna kontrollgenerna uttrycks konstant och påverkas inte av behandlingen.
Metoden lämpar sig i allmänhet för experiment med ett stort antal DNA-prover och ett lågt antal gener som ska testas.
Metoden med relativ standardkurva förutsätter att:
- det är lika stor effektivitet mellan kontrollproverna och de behandlade proverna.
Denna metod fungerar bättre om du har färre DNA-prover men ett större antal gener att testa.
Vad du behöver för dubbel Delta Ct-analys
- qPCR Ct-värden (rådata) för:
- den hushållsgen: kontroll- och försöksförhållanden;
- den intressanta genen: kontroll- och försöksförhållanden;
- Ett Excel-kalkylblad.
Och så är det! Ingen dyr programvara behövs.
Här är en snabb sammanfattning av de viktigaste stegen i dubbel delta Ct-analysen (för en detaljerad förklaring läs den här artikeln).
4 steg för dubbel delta Ct-analys
1. Ta medelvärdet av Ct-värdena för hushållsgenen och genen som testas i experiment- och kontrollförhållandena, vilket ger 4 värden. De fyra värdena är Gene som testas experimentellt (TE), Gene som testas kontroll (TC), Housekeeping Gene experimentellt (HE) och Housekeeping Gene kontroll (HC).
| Genomsnittligt experimentellt Ct-värde | Genomsnittligt experimentellt Ct-värde | Genomsnittligt kontroll Ct-värde | Genomsnittligt kontroll Ct-värde | \DeltaCt-värde (Experimentell) | \DeltaCt Value (Kontroll) |
|---|---|---|---|---|---|
| TE | HE | TC | HC | \DeltaCTE | \DeltaCTC |
| 21.27 | 20,23 | 19,60 | 19,27 | 1,03 | 0,33 |
2. Beräkna skillnaderna mellan försöksvärden (TE – HE) och kontrollvärden (TC – HC). Detta är dina \DeltaCt-värden för experimentella förhållanden (\DeltaCTE) respektive kontrollförhållanden (\DeltaCTC).
3. Beräkna sedan skillnaden mellan \DeltaCT-värdena för experimentella förhållanden och kontrollförhållanden (\DeltaCTE – \DeltaCTC) för att få fram det dubbla delta Ct-värdet (ddCt).
4. Eftersom alla beräkningar görs i logaritmbas 2, minskar dina Ct-värden med 1 varje gång det finns dubbelt så mycket DNA och halveras inte. Du måste beräkna värdet av 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} för att få uttrycket fold change.
| dCt-värde (experimentellt) | dCt-värde (kontroll) | ddCt-värde | Expression Fold Change |
|---|---|---|---|
| dCTE | dCTC | ddCt | 2^-ddCt |
| 1.03 | 0,33 | 0,70 | 0,615572207 |
Vad betyder värdet?
Nu när du har fått ditt värde för vikningsförändring, vad betyder det egentligen? Det här värdet är vikningsförändringen för din gen av intresse i testtillståndet i förhållande till kontrolltillståndet, som alla har normaliserats till din hushållsgen.
För att göra det lite tydligare – du kan tänka på det som en procentsats. En fold change på 1 innebär att det finns 100 % lika mycket genuttryck i ditt testtillstånd som i ditt kontrolltillstånd – det finns alltså ingen förändring mellan försöksgruppen och kontrollgruppen. Ett värde för fold-change över 1 visar en uppreglering av den aktuella genen i förhållande till kontrollen (1,2-faldig förändring = 120 % genuttryck i förhållande till kontrollen, 5 = 500 %, 10 = 1 000 % etc.). Värden under 1 visar på nedreglering av genen i förhållande till kontrollen (fold change på 0,5 är 50 % genuttryck i förhållande till kontrollen, alltså hälften så mycket uttryck som i kontrollen etc.).
Du kan presentera dessa data som stapeldiagram med fold-change, där kontrollförhållandena är lika med 1. Du kan också använda statistiska analyser för att kontrollera förändringarnas betydelse, t.ex. med hjälp av en variansanalys (ANOVA) eller t-test, beroende på vad som är lämpligt för din försöksuppställning!
Med hjälp av dessa steg kan du utföra din qPCR-analys var du än befinner dig, även om du är på en bilresa. För att göra det ännu enklare kan du skapa en Excel-mall som du kan använda varje gång. Då behöver du bara mata in dina data och du kommer att förvåna andra med din snabbhet att genomföra analyser!
Originellt publicerat den 9 juli 2016. Översyn och uppdatering den 8 februari 2021.
Fördjupad läsning
Livak KJ, Schmittgen TD. Analys av relativa genuttrycksdata med hjälp av kvantitativ PCR i realtid och 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} Metod. Metoder. 2001;25:402-8.
Har detta hjälpt dig? Dela gärna med dig till ditt nätverk.