Resultat
Avbildning av cAMP i primära cilier i levande celler med hjälp av fluorescerande biosensorer innebär flera unika utmaningar. För det första är cilierna små och smala och sticker ut 2-10 µm ovanför cellens yta, för det andra är de icke rörliga, men de är föremål för rörelse på grund av bulkflödet i badlösningen, och för det tredje kan det vara svårt att optiskt skilja bona fide-signaler från bakgrundsfluorescens som emanerar från cellkroppen. Även om flera cAMP-rapportörer riktade mot cilier har beskrivits tidigare (19, 24, 25), försökte vi generera ratiometriska biosensorer med förbättrad ljusstyrka och måltrogenhet. Efter att ha testat ett flertal konstruktioner fann vi att den bästa målinriktningen, ljusstyrkan och känsligheten erbjöds av den fjärde generationens Epac-baserade prober från Kees Jalink-laboratoriet (EpacH188 och en version med högre affinitet, EpacH187) (26) i kombination med Arl13b, ett protein som i hög grad är lokaliserat till cilier (27) (fig. 1A). Sensorer som innehåller 5-HT6-receptorn gav en jämförelsevis god lokalisering som Arl13b-kopplade prober; som diskuteras nedan orsakade dock 5-HT6-receptorer som inte är lokaliserade till cilier en förhöjning av cellulär cAMP på grund av den välkända konstitutiva aktiviteten hos denna GPCR (28).
cAMP-signalering i cilier av digitoninpermeabiliserade celler. Alla experiment utfördes i intracellulärliknande buffert kompletterad med ATP och GTP. (A) mIMCD3-celler som uttrycker 5-HT6-mCherry och Arl13b-H187 lokaliserat till både cellen och ciliet reagerade inte på 10 µM 5-HT i cellkroppen eller i ciliet efter 2 minuters behandling med 20 μg/mL digitonin (4 experiment, 5 cilier). (B) På samma sätt försvann responsen på den omvända agonisten, 1 µM SB742457, och den efterföljande 5-HT6-återgångsresponsen i både cell och cilium efter 2 minuters behandling med 20 μg/mL digitonin (3 försök, 3 cilier). (C) Permeabilisering med digitonin upphävde den 50 µM forskolininducerade cAMP-signalen i cellkroppar, men cAMP-ökningen kunde påvisas i cilier. 1 mM IBMX-inducerad PDE-hämning avmaskerade ingen signal (n = 4 experiment med 4 cilier/7 celler). (D) AC3-kotransfektion förändrade inte forskolinsvaret. (E) Kvantifiering och jämförelse av cAMP-svaret på forskolin i cellkroppar och cilier; **P = 0,0002, ***P = 00019. Blå spår = cellkropp, röda spår = cilier. Tidslinjer: Riktlinjer: 3 minuter. Y-axeln är förhållandet 480/535 nm.
En uppenbar förklaring till avsaknaden av effekt i de föregående experimenten var att cAMP inte ackumulerades tillräckligt för att fångas upp av reportern. När samma experiment upprepades med forskolin för att direkt aktivera endogena ACs (adenylylcyklasser) som finns i ciliarmembranet, upptäcktes emellertid en liten men konsekvent ackumulering av cAMP i ciliernas mikromiljö men inte i cellkroppen (fig. 4 C och E, vänstra stapeldiagrammen). Liknande resultat erhölls i celler som uttryckte AC3 (36) (fig. 4 D och E, höger stapeldiagram), som lokaliserades till cilier när den uttrycktes i mIMCD3-celler (SI Appendix, fig. S8). Om man antar att permeabiliseringen inte ledde till förlust av väsentliga komponenter i GPCR-signalmaskineriet, tyder den lilla men påvisbara förändringen efter tillsats av forskolin på att det borde ha varit möjligt att lösa upp GPCR-beroende cAMP-signaler om de skulle äga rum i cilium. Dessa data tyder också på att ciliarmembranet hos mIMCD3-cellerna lämnades intakt efter digitoninbehandlingen.
De föregående data lämnar oss med frågan varför GPCR:er inte är kompetenta att producera cAMP när de väl är instängda i cilium. Tidigare studier har nämnt Ca2+-inträde genom ciliarmembranet som en viktig regulator av organell cAMP på grund av närvaron av ciliespecifika Ca2+-ledande kanaler (PKD2L1 och PKD2) och Ca2+-reglerade ACs (AC1, 8, 5 och 6) (11, 16, 23, 32, 37). Primära cilier av mIMCD3-celler har rapporterats hysa Ca2+-hämmande AC5 och/eller AC6 (10). Vi ansåg därför att ciliernas höga vila och Ca2+permeabilitet (38, 39) skulle kunna förklara inaktiveringen av ACs kopplade till 5-HT6-receptorn. För att bättre ta itu med denna punkt förbättrade vi sensorn genom att ersätta Arl13b-målsekvensen med en funktionell 5-HT6-receptor för att rikta cAMP-reporter-GPCR-fusionen direkt mot cilium (5-HT6-EpacH187). I överensstämmelse med uppgifterna i figurerna 3I och 4C gav 5-HT ingen mätbar cAMP-signal när den var riktad uteslutande mot cilium (figur 5A). Exponering av celler för nominellt Ca2+ fria lösningar räddade inte 5-HT-svaret i cilierna (fig. 5B), vilket tyder på att Ca2+-inträde genom ciliemembranet inte undertryckte signalen. Vi ansåg att uttryck av 5-HT6 kanske förändrade den ciliära fördelningen av Gαs-proteinet i mIMCD3-celler, men immunfärgningsexperiment tyder på att så inte är fallet (SI Appendix, Fig. S9). När vi testade effekten av 5-HT i celler som förbehandlats med SAG (250 nM till 1 µM) för att aktivera Smo-receptorer (40) kunde vi dock återställa 5-HT6-receptorns känslighet för agonisten (Fig. 5C). Känslighet för den inversa agonisten var också uppenbar, vilket innebär att den konstitutiva aktiviteten återställdes (fig. 5D).
Hedgehog pathway activation ökar cAMP-svaret som rapporteras av 5-HT6-Epac-H187 till 5-HT och dopamin i primära cilier: (A) I överensstämmelse med uppgifterna i figurerna 3I och 4C reagerade mIMCD3-cellerna inte på 10 µM 5-HT när sensorn/receptorfusionen begränsades strikt till ciliarmembranet (6 experiment, 6 cilier). (B) Att dämpa det höga i cilier genom att placera cellerna i en nominellt Ca2+ fri lösning räddade inte 5-HT-stimulerad cAMP-signalering (5 experiment, 6 cilier). (C) Efter förbehandling över natten med 1 µM SAG svarade 5 av 6 cilier (6 experiment) på 5-HT-stimulering (**P = 0,000992). (D) Förbehandling med 1 µM SAG räddade svaret på 1 µM SB742257 (-35,5 ± 11,2 % under baslinjen i förhållande till den efterföljande cAMP-ökningen som framkallades av 10 µM 5-HT; typiskt för 4 experiment, 4 cilier). (E) En cAMP-ökning i NIH 3T3-cilier (typiskt för 9 experiment, 11 cilier) orsakades av 10 μM 5-HT. (F) Förbehandling över natten med 1 μM SAG ökade signifikant 5-HT-svaret (**P = 0,00034; 6 experiment, 7 cilier). Förbehandling över natten med 10 μM cyklopamin (Cyclo) hade en försumbar effekt (8 experiment, 9 cilier, stapeldiagram). (G och H) 100 nM somatostatin (SST) dämpade 5-HT-svaret i cilier som har SSTR3-GFP med och utan förbehandling med SAG (G: 5 experiment, 6 cilier; H: 2 experiment, 5 cilier). (I och J) SAG-förbehandling ökade 10 nM dopamin (DA)-svaret (I: 4 experiment, 4 cilier, J: 4 experiment, 6 cilier, **P = 0,002476). Blå spår, cellkropp, röda spår, cilier. Tidslinjer: 3 min. Y-axeln är FRET-förhållandet 480/535 nm. Stapeldiagrammen anger 5-HT- eller DA-svaret i procent av forskolin/IBMX-svaret; felmarkerna representerar SEM.
De föregående resultaten lämnade oss med frågan om huruvida den oväntade SAG-beroende uppregleringen av 5-HT6-receptorn som uttrycks i mIMCD3-celler var celltyp- och/eller GPCR-specifik. Till skillnad från mIMCD3 gav stimulering av 3T3-celler (fig. 5E) och MEFs (SI Appendix, fig. S10A) med 5-HT en mätbar kvotförändring som dock förstärktes signifikant efter SAG-behandling (fig. 5F och SI Appendix, fig. S10B). Intressant nog upphävde inte den glödgade receptorantagonisten cyklopamin, som skulle kunna förväntas ha motsatt effekt av SAG, 5-HT-stimulerad cAMP-signalering i primära cilier av 3T3-celler (stapeldiagram, fig. 5F).
Med hjälp av detta system kunde vi också utvärdera förmågan hos en ciliär Gαi-kopplad GPCR, SSTR3, att reversera serotonin-stimulerade cAMP-signaler i ciliet. Behandling av 3T3-celler som samuttrycker SSTR3-GFP och 5-HT6-H187 med somatostatin reverserade 5-HT-svaren tillbaka till baslinjen inom 2 minuter i närvaro och frånvaro av SAG-behandling (Fig. 5 G och H), vilket tyder på lokal kontroll av 5-HT6-funktionen. Vi testade sedan ytterligare hur SAG påverkade aktiviteten hos en annan ciliär Gαs-kopplad GPCR, dopamin D1R-receptorn (5). D1R-EGFP samexpressades med 5-HT6-H187 i 3T3-celler, och celler med fluorescens endast i cilierna valdes ut. Tio nanomolärt dopamin gav små men mätbara cAMP-signaler i kontrollceller (fig. 5I), och återigen förstärktes signalen signifikant efter SAG-behandling (fig. 5J; sammanfattas i stapeldiagrammet).