De allra flesta IHC/ICC-förfaranden innebär att vävnader och celler fixeras med hjälp av formaldehydbaserade fixeringsmedel. Protokollet nedan beskriver tekniken för att generera en 4 % formaldehydlösning i PBS. Det mest effektiva fixeringsmedlet måste bestämmas experimentellt.

Försiktighet: Formaldehyd är giftigt. Läs säkerhetsdatabladet innan du arbetar med denna kemikalie. Handskar och skyddsglasögon ska bäras och lösningarna ska göras i en dragskåp.

Läs protokollet i sin helhet innan du börjar.

Råvaror som krävs

  • Dejoniserat H2O
  • HCl (utspädd)
  • NaOH (1 N)
  • Paraformaldehydpulver
  • 1X PBS: 0,145 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0081 M Na2HPO4, 0,0015 M KH2PO4, pH 7.4

Material

  • Filterenheter
  • Glas och omrörningsstång (avsedd för formaldehydlösning)
  • Handskar och ögonskydd
  • Värmeplatta med magnetomrörare
  • Thermometer
  • Ventilerad huva

Förfarande

  1. För 1 L 4% formaldehyd, Tillsätt 800 ml 1X PBS till en glasbägare på en omrörningsplatta i en ventilerad huva. Värm under omrörning till cirka 60 °C. Se till att lösningen inte kokar.
  2. Tillsätt 40 g paraformaldehydpulver till den uppvärmda PBS-lösningen.
  3. Pulveret kommer inte omedelbart att lösas upp i lösningen. Höj långsamt pH genom att tillsätta 1 N NaOH droppvis från en pipett tills lösningen klarnar.
  4. När paraformaldehydet är upplöst ska lösningen kylas och filtreras.
  5. Justera lösningens volym till 1 L med 1X PBS.
  6. Kontrollera pH på nytt och justera det med små mängder utspädd HCl till ungefär 6.9.
  7. Lösningen kan alikvoteras och frysas eller förvaras vid 2-8 °C i upp till en månad.

Skillnaden mellan paraformaldehyd, formaldehyd och formalin

Paraformaldehyd (kemiskt namn är polyoximetylen) är ett pulver av polymeriserad formaldehyd som i sig inte kan fixera vävnader. För att kunna användas som vävnadsfixeringsmedel måste paraformaldehyd lösas upp i varmt vatten för att bli en formaldehydlösning. Formalin är en mättad formaldehydlösning i vatten (37 viktprocent, 40 volymprocent) som innehåller 10-15 procent metanol. Metanol tillsätts för att bromsa polymeriseringen till formaldehyd, vilket minskar formalins fixeringskraft. Formalin kan också framställas i alkoholfri form av pulveriserad paraformaldehyd.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.