De allra flesta IHC/ICC-förfaranden innebär att vävnader och celler fixeras med hjälp av formaldehydbaserade fixeringsmedel. Protokollet nedan beskriver tekniken för att generera en 4 % formaldehydlösning i PBS. Det mest effektiva fixeringsmedlet måste bestämmas experimentellt.
Försiktighet: Formaldehyd är giftigt. Läs säkerhetsdatabladet innan du arbetar med denna kemikalie. Handskar och skyddsglasögon ska bäras och lösningarna ska göras i en dragskåp.
Läs protokollet i sin helhet innan du börjar.
Råvaror som krävs
- Dejoniserat H2O
- HCl (utspädd)
- NaOH (1 N)
- Paraformaldehydpulver
- 1X PBS: 0,145 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0081 M Na2HPO4, 0,0015 M KH2PO4, pH 7.4
Material
- Filterenheter
- Glas och omrörningsstång (avsedd för formaldehydlösning)
- Handskar och ögonskydd
- Värmeplatta med magnetomrörare
- Thermometer
- Ventilerad huva
Förfarande
- För 1 L 4% formaldehyd, Tillsätt 800 ml 1X PBS till en glasbägare på en omrörningsplatta i en ventilerad huva. Värm under omrörning till cirka 60 °C. Se till att lösningen inte kokar.
- Tillsätt 40 g paraformaldehydpulver till den uppvärmda PBS-lösningen.
- Pulveret kommer inte omedelbart att lösas upp i lösningen. Höj långsamt pH genom att tillsätta 1 N NaOH droppvis från en pipett tills lösningen klarnar.
- När paraformaldehydet är upplöst ska lösningen kylas och filtreras.
- Justera lösningens volym till 1 L med 1X PBS.
- Kontrollera pH på nytt och justera det med små mängder utspädd HCl till ungefär 6.9.
- Lösningen kan alikvoteras och frysas eller förvaras vid 2-8 °C i upp till en månad.
Skillnaden mellan paraformaldehyd, formaldehyd och formalin
Paraformaldehyd (kemiskt namn är polyoximetylen) är ett pulver av polymeriserad formaldehyd som i sig inte kan fixera vävnader. För att kunna användas som vävnadsfixeringsmedel måste paraformaldehyd lösas upp i varmt vatten för att bli en formaldehydlösning. Formalin är en mättad formaldehydlösning i vatten (37 viktprocent, 40 volymprocent) som innehåller 10-15 procent metanol. Metanol tillsätts för att bromsa polymeriseringen till formaldehyd, vilket minskar formalins fixeringskraft. Formalin kan också framställas i alkoholfri form av pulveriserad paraformaldehyd.