12.9.2 Cross-linking
Nonostante gli apparenti vantaggi, l’uso di impalcature biologiche pone ancora una serie di problemi, in particolare la loro rapida biodegradazione in vivo, le preoccupazioni riguardanti l’immunogenicità e le risposte non volute o incomplete dei tessuti. Per superare queste preoccupazioni, i metodi di reticolazione sono stati impiegati nel corso dei decenni. La reticolazione gioca un ruolo nel rallentare la biodegradazione e nell’eliminare o ridurre la risposta delle specie incrociate alle proteine strutturali delle impalcature ECM (Courtman et al., 2001).
Il successo della reticolazione può essere apprezzato nello sviluppo di valvole cardiache bioprotesiche da tessuti xenogenici. Il passaggio dal trattamento con formaldeide e l’introduzione del cross-linking con glutaraldeide delle valvole cardiache bioprotesiche è considerato un importante risultato in questo campo (Zilla et al., 2007). Il cross-linking mantiene la superficie non trombogenica delle valvole cardiache bioprotesiche, riduce l’antigenicità e previene la degradazione, aumentando così la loro vita in vivo. Questa forma di fissazione delle valvole cardiache bioprotesiche viene utilizzata ancora oggi. Infatti, la concia al cromo del collagene è stata usata per più di 100 anni nella conservazione delle pelli animali nell’industria della pelle (Covington, 1997). Il processo comporta un legame ionico, covalente e idrogeno tra le specie di cromo e il collagene. Questa forma di stabilizzazione del biomateriale è stata anche utilizzata per produrre catgut cromico come materiale di sutura chirurgica (Van Winkle et al., 1975). Esistono varie altre forme di agenti reticolanti, sviluppati principalmente per necessità di migliorare le prestazioni delle valvole cardiache bioprotesiche e del tessuto pericardico in vivo, e per superare il fallimento associato alla calcificazione e alla citotossicità. Gli agenti di reticolazione vanno dalle ben note aldeidi (formaldeide e glutaraldeide) ai più recenti reticolanti bifunzionali come i composti poliepossilici e l’esametilene diisocianato. Altri agenti reticolanti moderni includono i reticolanti a lunghezza zero come l’azide acilica e i carbodiimmidi (Khor, 1997). Anche se la reticolazione con glutaraldeide è ancora usata per stabilizzare le impalcature biologiche, si stanno sviluppando nuovi metodi di reticolazione funzionali e possibilmente meno citotossici. Questi includono l’enzima microbico transglutaminasi, la genipina composta a base di erbe e il cross-linking dendrimerico multifunzionale (Garcia et al., 2007b; Duan et al., 2007; Chang et al., 2002; Chan et al, 2008).
Si sta passando dall’uso di bioprotesi non degradabili destinate a durare oltre la vita del paziente a ponteggi biodegradabili, che sono progettati per essere rimodellati in vivo nel tempo per riparare organi danneggiati o malati (Brody e Pandit, 2007; Badylak, 2007). La degradazione dell’impalcatura dovrebbe essere controllata e avvenire in parallelo per corrispondere al tasso di rigenerazione dei tessuti in vivo (Burugapalli et al., 2007). L’impalcatura biodegradabile usata per l’ingegneria tissutale deve anche fornire la funzione necessaria fino a quando il tessuto di nuova formazione può assumere questa funzione. In un’impalcatura biodegradabile idealizzata, man mano che le cellule ospiti invadono e popolano l’impalcatura impiantata, secernono nuova matrice extracellulare per sostituire l’impalcatura originale che si degrada ad un tasso predeterminato.
È stato dimostrato che il tasso di degradazione in vitro e in vivo di un’impalcatura biologica può essere personalizzato dal grado di cross-linking (Burugapalli et al., 2007). Liang et al. (2004) hanno esaminato l’influenza del grado di reticolazione sulla risposta del tessuto e sul modello di rigenerazione utilizzando pericardio bovino acellulare reticolato con genipina. In un modello di impianto sottocutaneo di ratto, hanno scoperto che il pericardio bovino acellulare non reticolato e minimamente reticolato veniva rapidamente degradato prima che potesse verificarsi la formazione di nuovo tessuto. Al contrario, nell’impalcatura moderatamente reticolata e altamente reticolata, sono state osservate nuove formazioni di collagene, anche se in quest’ultima, questo processo era limitato allo strato esterno dell’impalcatura a causa della sua maggiore capacità di resistere alla degradazione. Quando impalcature simili sono state impiantate come patch vascolare in un modello canino (Chang et al., 2004), uno strato intatto di endotelio è stato trovato sulla superficie interna dell’innesto, insieme a fibroblasti e cellule muscolari lisce ospiti nell’innesto acellulare. Questo si è verificato in misura minore nel pericardio bovino acellulare reticolato con glutaraldeide usato nello studio. Tuttavia, l’ispessimento intimale involontario e la metaplasia condroide sono stati osservati con entrambi i tipi di scaffold. In un altro studio, simile genipina-cross-linked pericardio bovino acellulare sono stati utilizzati per riparare difetti miocardici in un modello di ventricolo destro del ratto (Chang et al., 2005). L’ispessimento intimale coperto da cellule endoteliali è stato trovato sulla superficie endocardica. Le cellule mesoteliali sono state osservate anche sulle superfici esterne dell’innesto che si pensa resistano all’adesione. Cellule muscolari lisce, fibre neomuscolari, neocollagene, neoglicosaminoglicani e neocapillari sono stati osservati all’interno dell’impalcatura a quattro settimane dall’impianto.
La gelatina è stata usata come biomateriale per riparare difetti dei nervi periferici (Mligiliche et al., 1999; Gamez et al., 2004). Le impalcature degradabili preparate con gelatina e reticolate con genipina sono state usate come materiale di riempimento in una camera tubolare di silicio e sono servite come matrice extracellulare per guidare la rigenerazione dei nervi attraverso un gap di 10 mm del nervo sciatico nei ratti (Liu et al., 2004). È stato dimostrato che il residuo del riempimento ha impedito la migrazione e l’allungamento degli assoni (Verdu et al., 2002), e questo è stato pensato per essere dovuto al tempo di degradazione esteso del riempimento di gelatina (Bigi et al., 2002; Liu et al., 2004). Quando la gelatina reticolata è stata usata come condotto tubolare (invece che come materiale di riempimento) per colmare simili lacune nervose, fibre nervose rigenerate contenenti per lo più assoni non mielinizzati con cellule di Schwann circostanti sono state trovate attraverso la lacuna a sei settimane quando il condotto ha iniziato a degradarsi e la neovascolarizzazione è aumentata (Chen et al., 2005). C’era anche un denso tessuto cicatriziale nell’area esterna del nervo rigenerato. Un sottile strato di capsula fibrosa è stato osservato dopo l’impianto sottocutaneo, insieme alle attese risposte infiammatorie acute e croniche.
La concentrazione del reticolato è stata trovata per dettare la degradazione in vivo quando gli scaffold di gelatina-tricalcio fosfato reticolati sono stati impiantati sottocutaneamente (Yao et al., 2004). Un’impalcatura meno reticolata era associata a una maggiore degradazione, mentre un’impalcatura altamente reticolata mostrava una degradazione minima in vivo. L’uso di quantità più elevate di reticolato è stato anche associato a una maggiore formazione di capsule fibrose dell’impianto che è stata attribuita alla citotossicità del reticolato. Quando impalcature simili sono state impiantate per riparare i difetti ossei calvariali dei conigli, gli autori hanno scoperto che le impalcature venivano gradualmente degradate e sostituite da nuovo osso, anche se questo processo era limitato solo all’interfaccia osso-scaffold (Yao et al., 2005). Lo stesso composito reticolato con glutaraldeide ha indotto una risposta simile (Chen et al., 1998). C’era una degradazione graduale dell’impalcatura composita nel tempo, man mano che le impalcature venivano sostituite da nuovo osso, e la matrice acellulare veniva depositata dal bordo del difetto in senso centripeto. Mentre l’impalcatura ingegnerizzata può essere cruciale, altri fattori possono accelerare il processo di guarigione. Per esempio, l’aggiunta di ossigenoterapia iperbarica ha aumentato notevolmente la formazione di nuovo osso, come dimostrato da tecniche radiologiche e istomorfometriche (Chen et al., 2004). La presenza di fattori bioattivi, come BMP-2 in un’impalcatura degradabile ha indotto la formazione di osso ectopico per via sottocutanea e intramuscolare, e sembra accelerare il riassorbimento dovuto all’azione degli osteoclasti (Liang et al., 2005; Takahashi et al., 2005; Kato et al., 2006; Yoneda et al., 2005).