12.9.2 Cross-linking
Embora as vantagens aparentes, o uso de andaimes biológicos ainda coloca uma série de problemas, especificamente a sua rápida biodegradação in vivo, preocupações com a imunogenicidade e respostas não intencionais ou incompletas dos tecidos. A fim de superar estas preocupações, métodos de ligação cruzada têm sido utilizados ao longo das décadas. A reticulação desempenha um papel no abrandamento da biodegradação, bem como na eliminação ou redução da resposta inter-espécies às proteínas estruturais dos andaimes ECM (Courtman et al., 2001).
O sucesso da reticulação pode ser apreciado no desenvolvimento de válvulas cardíacas bio-protéticas a partir de tecidos xenogénicos. A mudança do tratamento com formaldeído e a introdução da reticulação do glutaraldeído nas válvulas cardíacas biopróticas é considerada uma grande conquista neste campo (Zilla et al., 2007). A reticulação mantém a superfície nãotrombogênica das válvulas cardíacas biopróteses, reduz a antigenicidade e previne a degradação, aumentando assim sua vida in vivo. Esta forma de fixação bio-protética das válvulas cardíacas ainda hoje é utilizada. Na verdade, o curtimento de colágeno com cromo tem sido usado há mais de 100 anos na preservação de peles de animais na indústria do couro (Covington, 1997). O processo envolve a ligação iônica, covalente e de hidrogênio entre espécies de cromo e colágeno. Esta forma de estabilização de biomateriais também tem sido utilizada para produzir catgut crómico como material de sutura cirúrgica (Van Winkle et al., 1975). Existem várias outras formas de agentes reticulantes, desenvolvidos principalmente por necessidade de melhorar o desempenho das válvulas cardíacas bio-protéticas e do tecido pericárdico in vivo, e para superar falhas associadas à calcificação e à citotoxicidade. Os agentes reticulantes variaram dos conhecidos aldeídos (formaldeído e glutaraldeído) aos mais recentes reticulados bifuncionais, como os compostos poli-epoxídicos e o diisocianato de hexametileno. Outros agentes reticulantes modernos incluem os reticulantes de comprimento zero, como azida acyl e carbodiimidas (Khor, 1997). Embora a reticulação do glutaraldeído ainda esteja a ser utilizada para estabilizar os andaimes biológicos, estão a ser desenvolvidos novos métodos funcionais e possivelmente menos citotóxicos de reticulação. Estes incluem a enzima transglutaminase microbiana, a genipina do composto herbal e a reticulação dendrimérica multifuncional (Garcia et al., 2007b; Duan et al., 2007; Chang et al., 2002; Chan et al, 2008).
Há uma mudança do uso de biopróteses não degradáveis destinadas a durar para além da vida do paciente para andaimes biodegradáveis, que são concebidos para serem remodelados in vivo ao longo do tempo para reparar órgãos danificados ou doentes (Brody e Pandit, 2007; Badylak, 2007). A degradação dos andaimes deve ser controlada e ocorrer em paralelo para corresponder à taxa de regeneração dos tecidos in vivo (Burugapalli et al., 2007). O andaime biodegradável utilizado para a engenharia de tecidos também deve fornecer a função necessária até que o tecido recém-formado possa assumir esta função. Em um andaime biodegradável idealizado, como as células hospedeiras invadem e povoam o andaime implantado, elas secretam nova matriz extracelular para substituir o andaime original que se degrada a uma taxa predeterminada.
Foi demonstrado que a taxa de degradação in vitro e in vivo de um andaime biológico pode ser adaptada pelo grau de ligação cruzada (Burugapalli et al., 2007). Liang et al. (2004) examinaram a influência da extensão da reticulação na resposta tecidual e no padrão de regeneração usando pericárdio bovino acelular reticulado com genipina. Em um modelo de implante subcutâneo de ratos, verificaram que o pericárdio bovino acelular não reticulado e minimamente reticulado foi rapidamente degradado antes que a formação de novos tecidos pudesse ocorrer. Em contraste, no andaime moderadamente reticulado e altamente reticulado, novas formações de colágeno foram observadas, embora neste último, este processo tenha sido limitado à camada externa do andaime devido à sua maior capacidade de resistir à degradação. Quando andaimes semelhantes foram implantados como mancha vascular em um modelo canino (Chang et al., 2004), uma camada intacta de endotélio foi encontrada na superfície interna do enxerto, juntamente com fibroblastos do hospedeiro e células musculares lisas no enxerto acelular. Isso ocorreu em menor grau no pericárdio bovino acelular cruzado do glutaraldeído utilizado no estudo. Entretanto, foram observados espessamento intimal não intencional e metaplasia condróide com ambos os tipos de andaimes. Em outro estudo, pericárdios bovinos acelulares genipina-cruzados semelhantes foram usados para reparar defeitos miocárdicos em um modelo de ventrículo direito de rato (Chang et al., 2005). Espessamento íntimo coberto com células endoteliais foi encontrado na superfície endocárdica. Também foram observadas células mesoteliais nas superfícies externas do enxerto que se pensa resistir à adesão. Células musculares lisas, fibras neomusculares, neocolágeno, neoglicosaminoglicanos e neocapilares foram observados dentro do andaime nas quatro semanas pós-implante.
Gelatina tem sido usada como biomaterial para reparar defeitos nervosos periféricos (Mligiliche et al., 1999; Gamez et al., 2004). Andaimes degradáveis preparados a partir de gelatina e reticulados com genipina foram usados como material de preenchimento em uma câmara tubular de silicone e serviram como matriz extracelular para guiar a regeneração nervosa através de uma lacuna do nervo ciático de 10 mm em ratos (Liu et al., 2004). Foi demonstrado que os resíduos do enchimento impediram a migração e alongamento dos axônios (Verdu et al., 2002), e isso se deveu ao tempo prolongado de degradação do enchimento de gelatina (Bigi et al., 2002; Liu et al., 2004). Quando a gelatina reticulada foi usada para servir como conduto tubular (ao invés de como material de preenchimento) para preencher lacunas nervosas similares, fibras nervosas regeneradas contendo na maioria dos casos axônios não mielinizados com células de Schwann ao redor foram encontradas através da lacuna às seis semanas, quando o conduto começou a se degradar e a neovascularização aumentou (Chen et al., 2005). Havia também tecido cicatricial denso na área externa do nervo regenerado. Uma fina camada de cápsula fibrosa foi observada após o implante subcutâneo, juntamente com as respostas inflamatórias agudas e crônicas esperadas.
A concentração dos reticulados foi encontrada para ditar a degradação in vivo quando os andaimes reticulados de gelatina e fosfato tricálcico foram implantados subcutâneamente (Yao et al., 2004). Um andaime menos reticulado foi associado a uma maior degradação, enquanto que um andaime altamente reticulado exibiu uma degradação in vivo mínima. O uso de maiores quantidades de reticulado também foi associado com o aumento da formação de cápsulas fibrosas de implantes que foi atribuído à citotoxicidade do reticulado. Quando andaimes semelhantes foram implantados para reparar defeitos ósseos calvários dos coelhos, os autores constataram que os andaimes foram gradualmente degradados e substituídos por novo osso, embora esse processo fosse limitado apenas na interface osso-base do andaime (Yao et al., 2005). O mesmo composto reticulado com glutaraldeído induziu uma resposta semelhante (Chen et al., 1998). Houve uma degradação gradual do andaime composto ao longo do tempo à medida que os andaimes foram sendo substituídos por um novo osso, e a matriz acelular foi estabelecida a partir da borda do defeito de forma centrípeta. Enquanto que o andaime artificial pode ser crucial, outros factores podem acelerar o processo de cicatrização. Por exemplo, a adição de oxigenoterapia hiperbárica aumentou muito a formação de novo osso, como mostram as técnicas radiológicas e histomorfométricas (Chen et al., 2004). A presença de fatores bioativos, como o BMP-2 em um andaime degradável induziu a formação óssea ectópica subcutânea e intramuscularmente, e pareceu acelerar a reabsorção devido à ação dos osteoclastos (Liang et al., 2005; Takahashi et al., 2005; Kato et al., 2006; Yoneda et al., 2005).