12.9.2 Cross-linking
Trots de uppenbara fördelarna innebär användningen av biologiska ställningar fortfarande ett antal problem, särskilt deras snabba biologiska nedbrytning in vivo, oro för immunogenicitet och oavsiktliga eller ofullständiga vävnadssvar. För att lösa dessa problem har tvärbindningsmetoder använts under årtiondena. Tvärbindning spelar en roll när det gäller att bromsa den biologiska nedbrytningen samt att eliminera eller minska responsen mellan olika arter på strukturella proteiner i ECM-ställningar (Courtman et al., 2001).
Tvärbindningens framgång kan uppskattas i utvecklingen av bioprotesiska hjärtklaffar från xenogena vävnader. Övergången från behandling med formaldehyd och införandet av korslänkning med glutaraldehyd av bioprotesiska hjärtklaffar anses vara en stor framgång på detta område (Zilla et al., 2007). Korsbindning bibehåller den icke-thrombogena ytan på bioprotesiska hjärtklaffar, minskar antigeniciteten och förhindrar nedbrytning, vilket ökar deras livslängd in vivo. Denna form av fixering av bioprotesiska hjärtklaffar används fortfarande i dag. Kromgarvning av kollagen har faktiskt använts i mer än 100 år för att konservera djurhudar inom läderindustrin (Covington, 1997). Processen inbegriper joniska, kovalenta och vätebindningar mellan kromarter och kollagen. Denna form av stabilisering av biomaterial har också använts för att framställa kromkatgut som kirurgiskt suturmaterial (Van Winkle et al., 1975). Det finns flera andra former av tvärbindande medel, som huvudsakligen har utvecklats av nödvändighet för att förbättra bioproteser av hjärtklaffar och perikardvävnad in vivo och för att övervinna misslyckanden i samband med förkalkning och cytotoxicitet. Tvärbindningsmedlen varierar från de välkända aldehyderna (formaldehyd och glutaraldehyd) till nyare bifunktionella tvärbindare som t.ex. polyepoxyföreningar och hexametylen-diisocyanat. Andra moderna tvärbindare är tvärbindare med noll längd, t.ex. acylazid och karbodiimider (Khor, 1997). Även om kryssbindning med glutaraldehyd fortfarande används för att stabilisera biologiska ställningar håller nyare funktionella och möjligen mindre cytotoxiska kryssbindningsmetoder på att utvecklas. Dessa inkluderar mikrobiellt transglutaminasenzym, örtföreningen genipin och multifunktionell dendrimerisk tvärbindning (Garcia et al., 2007b; Duan et al., 2007; Chang et al., 2002; Chan et al, 2008).
Det sker en övergång från att använda icke nedbrytbara bioproteser som är avsedda att hålla längre än patientens liv till biologiskt nedbrytbara ställningar, som är utformade för att omformas in vivo med tiden för att reparera skadade eller sjuka organ (Brody och Pandit, 2007; Badylak, 2007). Nedbrytningen av ställningarna bör kontrolleras och ske parallellt för att motsvara den hastighet med vilken vävnaden regenereras in vivo (Burugapalli et al., 2007). Den biologiskt nedbrytbara ställningen som används för vävnadsteknik måste också tillhandahålla den nödvändiga funktionen tills nybildad vävnad kan överta denna funktion. I en idealiserad biologiskt nedbrytbar ställning utsöndrar värdcellerna, när de invaderar och befolkar den implanterade ställningen, ny extracellulär matris för att ersätta den ursprungliga ställningen som bryts ned i en förutbestämd takt.
Det har visats att nedbrytningshastigheten in vitro och in vivo för en biologisk ställning kan skräddarsys genom graden av tvärbindning (Burugapalli et al., 2007). Liang et al. (2004) undersökte inflytandet av graden av tvärbindning på vävnadssvaret och regenerationsmönstret genom att använda acellulärt bovint perikardium tvärbundet med genipin. I en modell för subkutan implantation hos råttor fann de att icke tvärbundet och minimalt tvärbundet acellulärt bovint perikardium snabbt bröts ned innan ny vävnadsbildning kunde ske. I den måttligt tvärbundna och starkt tvärbundna ställningen observerades däremot nya kollagenbildningar, även om denna process i den sistnämnda ställningen var begränsad till ställningens yttre skikt på grund av dess större förmåga att motstå nedbrytning. När liknande ställningar implanterades som ett kärlplåster i en hundmodell (Chang et al., 2004) hittades ett intakt lager endotel på den inre ytan av transplantatet, tillsammans med värdfibroblaster och glatta muskelceller i det acellulära transplantatet. Detta inträffade i mindre utsträckning i det glutaraldehydkorslänkade acellulära bovina perikardiet som användes i studien. Oavsiktlig intimal förtjockning och kondroid metaplasi observerades dock med båda typerna av ställningar. I en annan studie användes liknande genipin-korsbundna acellulära bovina perikardier för att reparera myokarddefekter i en modell av råttans högra kammare (Chang et al., 2005). Intimal förtjockning täckt av endotelceller hittades på endokardialytan. Mesothelceller observerades också på de yttre ytorna av transplantatet som tros motstå adhesion. Släta muskelceller, neomuskelfibrer, neokollagen, neoglykosaminoglykaner och neokapillärer observerades inom ställningen fyra veckor efter implantation.
Gelatin har använts som biomaterial för att reparera perifera nervdefekter (Mligiliche et al., 1999; Gamez et al., 2004). Nedbrytbara ställningar framställda av gelatin och tvärbundna med genipin användes som fyllnadsmaterial i en rörformig kiselkammare och fungerade som extracellulär matris för att vägleda nervregeneration över en 10 mm lång ischiasnervsklyfta hos råttor (Liu et al., 2004). Det visades att rester av fyllningen förhindrade migration och förlängning av axoner (Verdu et al., 2002), och detta antogs bero på den förlängda nedbrytningstiden för gelatinfyllningen (Bigi et al., 2002; Liu et al., 2004). När tvärbundet gelatin användes som tubulär kanal (i stället för som fyllnadsmaterial) för att överbrygga liknande nervgap, hittades regenererade nervfibrer innehållande mestadels icke-myeliniserade axoner med omgivande Schwann-celler tvärs över gapet efter sex veckor, då kanalen började brytas ned och neovaskulariseringen ökade (Chen et al., 2005). Det fanns också tät ärrvävnad i det yttre området av den regenererade nerven. Ett tunt lager av fibrös kapsel observerades efter subkutan implantation, tillsammans med de förväntade akuta och kroniska inflammatoriska reaktionerna.
Koncentrationen av den tvärbundna befanns diktera nedbrytningen in vivo när tvärbundna gelatin-trikalciumfosfatställningar implanterades subkutant (Yao et al., 2004). Mindre tvärbundna ställningar var förknippade med högre nedbrytning medan starkt tvärbundna ställningar uppvisade minimal nedbrytning in vivo. Användningen av större mängder tvärbunden var också förknippad med ökad bildning av fibrösa kapslar i implantatet, vilket tillskrevs cytotoxicitet hos den tvärbundna. När liknande ställningar implanterades för att reparera kaniners kalvariala bendefekter fann författarna att ställningarna gradvis degraderades och ersattes av nytt ben, även om denna process begränsades endast vid gränssnittet mellan ben och ställningar (Yao et al., 2005). Samma komposit som korslänkats med glutaraldehyd gav en liknande reaktion (Chen et al., 1998). Det skedde en gradvis nedbrytning av kompositställningen med tiden när ställningarna ersattes av nytt ben och acellulär matris lades ner från defektens kant centripetalt. Även om den konstruerade ställningen kan vara avgörande kan andra faktorer påskynda läkningsprocessen. Till exempel ökade tillägget av hyperbar syrebehandling kraftigt den nya benbildningen, vilket visades genom radiologiska och histomorfometriska tekniker (Chen et al., 2004). Närvaron av bioaktiva faktorer, t.ex. BMP-2, i en nedbrytbar ställning inducerade ektopisk benbildning subkutant och intramuskulärt och verkade påskynda resorptionen på grund av osteoklasternas verkan (Liang et al., 2005; Takahashi et al., 2005; Kato et al., 2006; Yoneda et al., 2005).