12.9.2 Cross-linking
Ondanks de duidelijke voordelen levert het gebruik van biologische scaffolds nog steeds een aantal problemen op, met name hun snelle biologische afbraak in vivo, bezorgdheid over immunogeniciteit, en onbedoelde of onvolledige weefselreacties. Om deze problemen op te lossen zijn in de loop van de decennia cross-linking methoden toegepast. Verknoping speelt een rol bij het vertragen van de biologische afbraak, alsmede het elimineren of verminderen van cross-species reactie op structurele eiwitten van ECM scaffolds (Courtman et al., 2001).
Het succes van verknoping kan worden gewaardeerd in de ontwikkeling van bioprosthetische hartkleppen van xenogene weefsels. De verschuiving van formaldehydebehandeling en de invoering van glutaaraldehyde cross-linking van bioprothetische hartkleppen wordt beschouwd als een belangrijke prestatie op dit gebied (Zilla et al., 2007). Kruiskoppeling houdt het niet-trombogene oppervlak van bioprothetische hartkleppen in stand, vermindert de antigeniciteit en voorkomt degradatie, waardoor hun in vivo levensduur wordt verlengd. Deze vorm van fixatie van bioprothetische hartkleppen wordt vandaag de dag nog steeds gebruikt. Het looien van collageen met chroom wordt namelijk al meer dan 100 jaar gebruikt bij de conservering van dierenhuiden in de leerindustrie (Covington, 1997). Bij dit proces vindt een ionische, covalente en waterstofbinding plaats tussen chroomverbindingen en collageen. Deze vorm van biomateriaalstabilisatie is ook gebruikt voor de productie van chromisch katgut als chirurgisch hechtmateriaal (Van Winkle et al., 1975). Er bestaan verschillende andere vormen van cross-linking middelen, die voornamelijk zijn ontwikkeld uit noodzaak om de prestaties van bioprothetische hartkleppen en pericardweefsel in vivo te verbeteren, en om falen in verband met verkalking en cytotoxiciteit te ondervangen. Verknopingsmiddelen variëren van de bekende aldehyden (formaldehyde en glutaaraldehyde) tot nieuwere bifunctionele verknopingsmiddelen zoals polyepoxyverbindingen en hexamethyleendiisocyanaat. Andere moderne cross-linking middelen zijn de nul-lengte cross-linkeds zoals acyl azide en carbodiimiden (Khor, 1997). Hoewel glutaaraldehyde cross-linking nog steeds wordt gebruikt om biologische scaffolds te stabiliseren, worden er nieuwere functionele en mogelijk minder cytotoxische cross-linking methoden ontwikkeld. Deze omvatten microbieel transglutaminase enzym, kruidenverbinding genipine, en multifunctionele dendrimerische cross-linking (Garcia et al., 2007b; Duan et al., 2007; Chang et al., 2002; Chan et al,
Er is een verschuiving gaande van het gebruik van niet-afbreekbare bioprothesen die bedoeld zijn om langer mee te gaan dan het leven van de patiënt, naar biologisch afbreekbare steigers, die ontworpen zijn om in de loop van de tijd in vivo te worden omgevormd om beschadigde of zieke organen te herstellen (Brody en Pandit, 2007; Badylak, 2007). De afbraak van de steiger moet worden gecontroleerd en parallel verlopen aan de snelheid van de weefselregeneratie in vivo (Burugapalli et al., 2007). De biologisch afbreekbare steiger die voor weefselmanipulatie wordt gebruikt, moet ook de nodige functie vervullen tot het nieuw gevormde weefsel deze functie kan overnemen. In een geïdealiseerde biologisch afbreekbare steiger, als gastheercellen binnenvallen en bevolken de geïmplanteerde steiger, ze scheiden nieuwe extracellulaire matrix ter vervanging van de oorspronkelijke steiger die degradeert tegen een vooraf bepaalde snelheid.
Het is aangetoond dat de snelheid van in vitro en in vivo degradatie van een biologische steiger kan worden afgestemd door de mate van verknoping (Burugapalli et al., 2007). Liang et al. (2004) onderzochten de invloed van de mate van verknoping op de weefselrespons en het regeneratiepatroon door acellulair runderpericardium te gebruiken dat verknoopt is met genipine. In een onderhuids implantatiemodel bij ratten ontdekten zij dat niet-vernet en minimaal vernet acellulair runderpericard snel werden afgebroken voordat nieuwe weefselvorming kon optreden. In de matig vernette en sterk vernette steiger daarentegen, werden nieuwe collageenformaties waargenomen, hoewel dit proces in de laatste beperkt bleef tot de buitenste laag van de steiger vanwege het grotere vermogen om degradatie te weerstaan. Toen soortgelijke steigers werden geïmplanteerd als een vasculaire patch in een hond model (Chang et al., 2004), werd een intacte laag endotheel gevonden op het binnenoppervlak van het transplantaat, samen met gastheer fibroblasten en gladde spiercellen in het acellulaire transplantaat. Dit gebeurde in mindere mate in het glutaaraldehyde cross-linked acellulair runderpericard dat in de studie werd gebruikt. Onbedoelde intimale verdikking en chondroïde metaplasie werden echter waargenomen bij beide steigertypes. In een andere studie werden gelijkaardige genipin-cross-linked acellulaire runderpericardia gebruikt om myocardiale defecten te herstellen in een rat rechter ventrikelmodel (Chang et al., 2005). Op het endocardiale oppervlak werden intimaverdikkingen aangetroffen die bedekt waren met endotheelcellen. Mesotheelcellen werden ook waargenomen op de buitenoppervlakken van het transplantaat, waarvan wordt aangenomen dat het weerstand biedt tegen adhesie. Gladde spiercellen, neomusculaire vezels, neocollageen, neoglycosaminoglycanen en neocapillairen werden waargenomen binnen de steiger vier weken na implantatie.
Gelatine is gebruikt als biomateriaal om perifere zenuwdefecten te herstellen (Mligiliche et al., 1999; Gamez et al., 2004). Afbreekbare scaffolds bereid uit gelatine en verknoopt met genipine werden gebruikt als vulmateriaal in een buisvormige siliciumkamer en dienden als extracellulaire matrix om zenuwregeneratie te begeleiden over een 10 mm heupzenuwkloof bij ratten (Liu et al., 2004). Er werd aangetoond dat het residu van de vulling de migratie en rek van axonen verhinderde (Verdu et al., 2002), en men dacht dat dit te wijten was aan de verlengde afbraaktijd van de gelatinevulling (Bigi et al., 2002; Liu et al., 2004). Wanneer vernette gelatine werd gebruikt als buisvormig kanaal (in plaats van als vulmateriaal) om vergelijkbare zenuwspleet te overbruggen, werden geregenereerde zenuwvezels met voornamelijk ongemyeliniseerde axonen met omliggende Schwann cellen gevonden over de spleet na zes weken, toen de buis begon te degraderen en de neovascularisatie toenam (Chen et al., 2005). Er was ook dicht littekenweefsel in het buitenste gebied van de geregenereerde zenuw. Een dunne laag vezelig kapsel werd waargenomen na subcutane implantatie, samen met de verwachte acute en chronische ontstekingsreacties.
De concentratie van de cross-linked bleek de in vivo degradatie te dicteren wanneer cross-linked gelatine-tricalcium fosfaat scaffolds subcutaan werden geïmplanteerd (Yao et al., 2004). Minder cross-linked steigers werden geassocieerd met een hogere degradatie, terwijl sterk cross-linked steigers een minimale in vivo degradatie vertoonden. Het gebruik van hogere hoeveelheden cross-linked werd ook geassocieerd met verhoogde implantaat vezelige kapselvorming die werd toegeschreven aan cytotoxiciteit van de cross-linked. Toen gelijkaardige scaffolds geïmplanteerd werden om botdefecten in het calvariale gebied van konijnen te herstellen, stelden de auteurs vast dat de scaffolds geleidelijk aan afgebroken werden en vervangen werden door nieuw bot, ook al was dit proces enkel beperkt op het raakvlak tussen bot en scaffold (Yao et al., 2005). Dezelfde composiet verknoopt met glutaaraldehyde induceerde een soortgelijke reactie (Chen et al., 1998). Er was een geleidelijke afbraak van de composietsteiger na verloop van tijd, naarmate de steigers werden vervangen door nieuw bot, en acellulaire matrix werd neergelegd vanaf de rand van het defect centripetaal. Hoewel de gemaakte steiger van cruciaal belang kan zijn, kunnen andere factoren het genezingsproces versnellen. Zo zorgde de toevoeging van hyperbare zuurstoftherapie voor een aanzienlijke toename van nieuwe botvorming, zoals aangetoond door radiologische en histomorfometrische technieken (Chen et al., 2004). De aanwezigheid van bioactieve factoren, zoals BMP-2 in een afbreekbare steiger, induceerde subcutane en intramusculaire ectopische botvorming, en leek de resorptie te versnellen door de werking van osteoclasten (Liang et al., 2005; Takahashi et al., 2005; Kato et al., 2006; Yoneda et al., 2005).