12.9.2 Cross-linking
På trods af de åbenlyse fordele giver brugen af biologiske stilladser stadig anledning til en række problemer, især deres hurtige biologiske nedbrydning in vivo, bekymringer vedrørende immunogenicitet og utilsigtede eller ufuldstændige vævsreaktioner. For at overvinde disse problemer er der i årtier blevet anvendt tværbindingsmetoder. Krydsbinding spiller en rolle med hensyn til at bremse den biologiske nedbrydning samt eliminere eller reducere tværartsreaktioner på ECM-stillads strukturproteiner (Courtman et al., 2001).
Krydsbindingens succes kan vurderes i forbindelse med udviklingen af bioprostetiske hjerteklapper fra xenogene væv. Skiftet fra formaldehydbehandling og indførelsen af krydsbinding med glutaraldehyd af bioprostetiske hjerteklapper anses for at være en stor bedrift på dette område (Zilla et al., 2007). Krydsbinding opretholder den ikke-thrombogene overflade af bioprostetiske hjerteklapper, reducerer antigeniciteten og forhindrer nedbrydning, hvorved deres levetid in vivo øges. Denne form for fiksering af bioprothetiske hjerteklapper anvendes stadig i dag. Chromgarvning af kollagen har faktisk været anvendt i mere end 100 år til konservering af dyreskind i læderindustrien (Covington, 1997). Processen involverer ioniske, kovalente og hydrogenbindinger mellem kromarter og kollagen. Denne form for stabilisering af biomaterialer er også blevet anvendt til at fremstille chromisk catgut som kirurgisk suturmateriale (Van Winkle et al., 1975). Der findes forskellige andre former for tværbindingsmidler, som hovedsagelig er udviklet af nødvendighed for at forbedre bioproteser af hjerteklapper og perikardialt væv in vivo og for at overvinde fejl i forbindelse med forkalkning og cytotoksicitet. Tværbindingsmidlerne spænder fra de velkendte aldehyder (formaldehyd og glutaraldehyd) til nyere bifunktionelle tværbindingsmidler såsom polyepoxyforbindelser og hexamethylendiisocyanat. Andre moderne tværbindingsmidler omfatter nul-længde tværbindinger som acylazid og carbodiimider (Khor, 1997). Selv om krydsbinding med glutaraldehyd stadig anvendes til stabilisering af biologiske stilladser, er der ved at blive udviklet nyere funktionelle og muligvis mindre cytotoksiske krydsbindingsmetoder. Disse omfatter mikrobielt transglutaminaseenzym, urteforbindelsen genipin og multifunktionel dendrimerisk tværbinding (Garcia et al., 2007b; Duan et al., 2007; Chang et al., 2002; Chan et al., 2002), 2008).
Der sker et skift fra anvendelse af ikke nedbrydelige bioproteser, der er beregnet til at holde længere end patientens liv, til bionedbrydelige stilladser, som er designet til at blive remodelleret in vivo over tid for at reparere beskadigede eller syge organer (Brody og Pandit, 2007; Badylak, 2007). Nedbrydningen af stilladset bør kontrolleres og foregå parallelt for at matche vævsregenereringens hastighed in vivo (Burugapalli et al., 2007). Det bionedbrydelige stillads, der anvendes til vævsmanipulation, skal også varetage den nødvendige funktion, indtil det nydannede væv kan overtage denne funktion. I et idealiseret bionedbrydeligt stillads udskiller værtscellerne, efterhånden som de invaderer og befolker det implanterede stillads, ny ekstracellulær matrix til erstatning for det oprindelige stillads, som nedbrydes med en forudbestemt hastighed.
Det er blevet vist, at hastigheden af in vitro- og in vivo-nedbrydning af et biologisk stillads kan tilpasses ved hjælp af graden af tværbinding (Burugapalli et al., 2007). Liang et al. (2004) undersøgte indflydelsen af graden af tværbinding på vævsrespons og regenerationsmønster ved at anvende acellulært bovint perikardie, der er tværbundet med genipin. I en subkutan implantationsmodel hos rotter fandt de, at ikke-krydsbundet og minimalt krydsbundet acellulært bovint perikardium hurtigt blev nedbrudt, før der kunne dannes nyt væv. I modsætning hertil blev der i det moderat tværbundne og stærkt tværbundne stillads observeret nye kollagendannelser, selv om denne proces i sidstnævnte var begrænset til stilladsets yderste lag på grund af dets større evne til at modstå nedbrydning. Da lignende stilladser blev implanteret som et vaskulært plaster i en hundemodel (Chang et al., 2004), blev der fundet et intakt lag af endotel på den indre overflade af transplantatet sammen med værtsfibroblaster og glatte muskelceller i det acellulære transplantat. Dette skete i mindre grad i det glutaraldehydkrydsede acellulære bovine pericardium, der blev anvendt i undersøgelsen. Der blev imidlertid observeret utilsigtet intimal fortykkelse og chondroid metaplasi med begge stilladstyper. I en anden undersøgelse blev lignende genipin-krydsede acellulære bovine perikardier anvendt til at reparere myokarddefekter i en rottehøjre ventrikelmodel (Chang et al., 2005). Intimal fortykkelse dækket af endothelceller blev fundet på endokardialoverfladen. Der blev også observeret mesothelceller på de ydre overflader af transplantatet, som menes at kunne modstå adhæsion. Der blev observeret glatte muskelceller, neomuskelfibre, neokollagen, neoglykosaminoglykaner og neokapillærer inden for stilladset fire uger efter implantation.
Gelatine er blevet anvendt som biomateriale til at reparere perifere nervedefekter (Mligiliche et al., 1999; Gamez et al., 2004). Nedbrydelige stilladser fremstillet af gelatine og tværbundet med genipin blev anvendt som fyldmateriale i et rørformet siliciumkammer og fungerede som ekstracellulær matrix til at styre nervefornyelsen over et 10 mm iskiasnervegab hos rotter (Liu et al., 2004). Det blev vist, at resterne af fyldet forhindrede migration og forlængelse af axoner (Verdu et al., 2002), og dette blev antaget at skyldes den forlængede nedbrydningstid for gelatinefyldningen (Bigi et al., 2002; Liu et al., 2004). Da tværbunden gelatine blev anvendt som rørformet kanal (i stedet for som fyldmateriale) til at bygge bro over lignende nervekløfter, blev der fundet regenererede nervefibre indeholdende hovedsagelig umyeliniserede axoner med omgivende Schwann-celler på tværs af kløften efter seks uger, da kanalen begyndte at blive nedbrudt og neovaskulariseringen øgedes (Chen et al., 2005). Der var også tæt arvæv i det ydre område af den regenererede nerve. Der blev observeret et tyndt lag af fibrøs kapsel efter subkutan implantation sammen med de forventede akutte og kroniske inflammatoriske reaktioner.
Koncentrationen af den tværbundne blev fundet at diktere in vivo nedbrydningen, når tværbundne gelatine-tricalciumphosphat-stilladser blev implanteret subkutant (Yao et al., 2004). Mindre tværbundne stilladser var forbundet med højere nedbrydning, mens stærkt tværbundne stilladser udviste minimal in vivo nedbrydning. Brugen af større mængder tværbunden var også forbundet med øget dannelse af fibrøse kapsler i implantatet, hvilket blev tilskrevet cytotoksiciteten af den tværbundne. Da lignende stilladser blev implanteret til reparation af kaniners calvariale knogledefekter, fandt forfatterne, at stilladserne gradvist blev nedbrudt og erstattet af ny knogle, selv om denne proces kun var begrænset til grænsefladen mellem knogle og stillads (Yao et al., 2005). Den samme komposit, der var tværbundet med glutaraldehyd, fremkaldte en lignende reaktion (Chen et al., 1998). Der skete en gradvis nedbrydning af kompositstilladset over tid, efterhånden som stilladset blev erstattet af ny knogle, og acellulær matrix blev lagt ned fra kanten af defekten centripetalt. Selv om det konstruerede stillads kan være afgørende, kan andre faktorer fremskynde helingsprocessen. For eksempel øgede tilføjelsen af hyperbar oxygenbehandling i høj grad den nye knogledannelse, hvilket blev påvist ved hjælp af radiologiske og histomorfometriske teknikker (Chen et al., 2004). Tilstedeværelsen af bioaktive faktorer, såsom BMP-2 i et nedbrydeligt stillads, inducerede ektopisk knogledannelse subkutant og intramuskulært og syntes at fremskynde resorptionen på grund af osteoklasternes virkning (Liang et al., 2005; Takahashi et al., 2005; Kato et al., 2006; Yoneda et al., 2005).