12.9.2 Zesíťování
Přes zjevné výhody představuje použití biologických scaffoldů stále řadu problémů, zejména jejich rychlou biodegradaci in vivo, obavy týkající se imunogenity a nezamýšlené nebo neúplné reakce tkání. K překonání těchto obav byly v průběhu desetiletí použity metody zesíťování. Zesíťování hraje roli při zpomalení biodegradace a také při eliminaci nebo snížení mezidruhové reakce na strukturální proteiny scaffoldů ECM (Courtman et al., 2001).
Úspěch zesíťování lze ocenit při vývoji bioprotetických srdečních chlopní z xenogenních tkání. Za významný úspěch v této oblasti se považuje odklon od formaldehydového ošetření a zavedení glutaraldehydového síťování bioprotetických srdečních chlopní (Zilla et al., 2007). Zesíťování udržuje netrombogenní povrch bioprotetických srdečních chlopní, snižuje antigenicitu a zabraňuje degradaci, čímž prodlužuje jejich životnost in vivo. Tato forma fixace bioprotetických srdečních chlopní se používá dodnes. Chromování kolagenu se totiž používá již více než 100 let při konzervaci zvířecích kůží v kožedělném průmyslu (Covington, 1997). Tento proces zahrnuje iontovou, kovalentní a vodíkovou vazbu mezi druhy chromu a kolagenem. Tato forma stabilizace biomateriálu byla rovněž využita k výrobě chromového katgutu jako chirurgického šicího materiálu (Van Winkle et al., 1975). Existují různé další formy zesíťovacích látek, které byly vyvinuty především z nutnosti zlepšit vlastnosti bioprotetických srdečních chlopní a perikardiální tkáně in vivo a překonat selhání spojená s kalcifikací a cytotoxicitou. Síťovací činidla sahala od dobře známých aldehydů (formaldehyd a glutaraldehyd) až po novější bifunkční síťovací činidla, jako jsou polyepoxidové sloučeniny a hexamethylen diisokyanát. Mezi další moderní síťovací činidla patří síťovací činidla s nulovou délkou, jako je acyl azid a karbodiimidy (Khor, 1997). Přestože se glutaraldehydové síťování stále používá ke stabilizaci biologických scaffoldů, vyvíjejí se novější funkční a pravděpodobně méně cytotoxické metody síťování. Mezi ně patří mikrobiální enzym transglutamináza, rostlinná sloučenina genipin a multifunkční dendrimerní síťování (Garcia et al., 2007b; Duan et al., 2007; Chang et al., 2002; Chan et al.,
Přechází se od používání nedegradabilních bioprotéz, které mají vydržet i po skončení života pacienta, k biodegradabilním scaffoldům, které jsou navrženy tak, aby se v průběhu času remodelovaly in vivo a opravovaly poškozené nebo nemocné orgány (Brody a Pandit, 2007; Badylak, 2007). Degradace lešení by měla být řízená a měla by probíhat souběžně, aby odpovídala rychlosti regenerace tkání in vivo (Burugapalli et al., 2007). Biodegradabilní scaffold použitý pro tkáňové inženýrství musí také zajišťovat potřebnou funkci, dokud tuto funkci nepřevezme nově vytvořená tkáň. V idealizovaném biodegradabilním scaffoldu, jak hostitelské buňky napadají a osídlují implantovaný scaffold, vylučují novou extracelulární matrix, která nahrazuje původní scaffold, jenž degraduje předem stanovenou rychlostí.
Ukázalo se, že rychlost degradace biologického scaffoldu in vitro a in vivo lze přizpůsobit míře zesíťování (Burugapalli et al., 2007). Liang et al. (2004) zkoumali vliv míry zesíťování na reakci tkáně a vzor regenerace pomocí acelulárního hovězího perikardu zesíťovaného genipinem. Na modelu subkutánní implantace u potkanů zjistili, že nezesíťovaný a minimálně zesíťovaný acelulární bovinní perikard byl rychle degradován dříve, než mohlo dojít k tvorbě nové tkáně. Naproti tomu u středně zesíťovaného a vysoce zesíťovaného scaffoldu byla pozorována tvorba nového kolagenu, i když u druhého jmenovaného byl tento proces omezen na vnější vrstvu scaffoldu kvůli jeho větší schopnosti odolávat degradaci. Když byly podobné scaffoldy implantovány jako cévní záplata na modelu psa (Chang et al., 2004), byla na vnitřním povrchu štěpu nalezena neporušená vrstva endotelu spolu s hostitelskými fibroblasty a hladkými svalovými buňkami v acelulárním štěpu. K tomu došlo v menší míře u glutaraldehydem zesíťovaného acelulárního bovinního perikardu použitého v této studii. U obou typů scaffoldů však bylo pozorováno nechtěné ztluštění intimy a chondroidní metaplazie. V jiné studii byl podobný genipinem zesíťovaný acelulární bovinní perikard použit k opravě defektů myokardu na modelu pravé komory potkana (Chang et al., 2005). Na povrchu endokardu bylo zjištěno intimální ztluštění pokryté endoteliálními buňkami. Mezotelové buňky byly pozorovány také na vnějším povrchu štěpu, o kterém se předpokládá, že odolává adhezi. Ve čtyřech týdnech po implantaci byly uvnitř scaffoldu pozorovány buňky hladké svaloviny, neomuskulární vlákna, neokolagen, neoglykosaminoglykany a neokapiláry.
Želatina byla použita jako biomateriál k reparaci defektů periferních nervů (Mligiliche et al., 1999; Gamez et al., 2004). Rozložitelné scaffoldy připravené z želatiny a zesítěné genipinem byly použity jako výplňový materiál v trubicové křemíkové komoře a sloužily jako extracelulární matrix k vedení regenerace nervu přes 10mm mezeru sedacího nervu u potkanů (Liu et al., 2004). Ukázalo se, že zbytky výplně brání migraci a prodlužování axonů (Verdu et al., 2002), a předpokládalo se, že je to způsobeno prodlouženou dobou degradace želatinové výplně (Bigi et al., 2002; Liu et al., 2004). Když byla zesíťovaná želatina použita jako tubulární konduit (místo jako výplňový materiál) k překlenutí podobných nervových mezer, byla přes mezeru nalezena regenerovaná nervová vlákna obsahující převážně nemyelinizované axony s okolními Schwannovými buňkami po šesti týdnech, kdy konduit začal degradovat a zvýšila se neovaskularizace (Chen et al., 2005). Ve vnější oblasti regenerovaného nervu se rovněž nacházela hustá zjizvená tkáň. Po subkutánní implantaci byla pozorována tenká vrstva vláknitého pouzdra spolu s očekávanou akutní a chronickou zánětlivou reakcí.
Bylo zjištěno, že při subkutánní implantaci zesíťovaných gelatinovo-trikalciumfosfátových scaffoldů určuje jejich degradaci in vivo jejich koncentrace (Yao et al., 2004). Méně zesíťovaný scaffold byl spojen s vyšší degradací, zatímco vysoce zesíťovaný scaffold vykazoval minimální degradaci in vivo. Použití vyššího množství síťovaného materiálu bylo také spojeno se zvýšenou tvorbou vláknité kapsuly implantátu, která byla přisuzována cytotoxicitě síťovaného materiálu. Když byly podobné scaffoldy implantovány králíkům k opravě defektů kalváriální kosti, autoři zjistili, že scaffoldy postupně degradují a jsou nahrazovány novou kostí, i když tento proces byl omezen pouze na rozhraní kosti a scaffoldu (Yao et al., 2005). Stejný kompozit zesíťovaný glutaraldehydem vyvolal podobnou reakci (Chen et al., 1998). V průběhu času docházelo k postupné degradaci kompozitního scaffoldu, protože scaffoldy byly nahrazovány novou kostí a acelulární matrix se ukládala od okraje defektu centripetálně. Ačkoli může být konstruovaný scaffold klíčový, proces hojení mohou urychlit i další faktory. Například přidání hyperbarické kyslíkové terapie výrazně zvýšilo tvorbu nové kosti, jak ukázaly radiologické a histomorfometrické techniky (Chen et al., 2004). Přítomnost bioaktivních faktorů, jako je BMP-2 v rozložitelném scaffoldu, indukovala ektopickou tvorbu kosti subkutánně a intramuskulárně a zřejmě urychlila resorpci v důsledku působení osteoklastů (Liang et al., 2005; Takahashi et al., 2005; Kato et al., 2006; Yoneda et al., 2005).
.