Ergebnisse
Die Visualisierung von cAMP im primären Zilium lebender Zellen mit fluoreszierenden Biosensoren stellt mehrere besondere Herausforderungen dar. Erstens sind Zilien klein und schlank und ragen 2-10 µm über die Oberfläche der Zelle hinaus; zweitens sind sie zwar nicht beweglich, aber durch die Strömung in der Badelösung in Bewegung, und drittens können echte Ziliensignale optisch schwer von der Hintergrundfluoreszenz, die vom Zellkörper ausgeht, zu trennen sein. Zwar wurden bereits mehrere auf das Zilium ausgerichtete cAMP-Reporter beschrieben (19, 24, 25), doch wir wollten ratiometrische Biosensoren mit verbesserter Helligkeit und Zielgenauigkeit entwickeln. Nachdem wir zahlreiche Designs getestet hatten, stellten wir fest, dass die Epac-basierten Sonden der vierten Generation aus dem Labor von Kees Jalink (EpacH188 und eine Version mit höherer Affinität, EpacH187) (26) in Kombination mit Arl13b, einem stark an Zilien lokalisierten Protein (27), die beste Zielgenauigkeit, Helligkeit und Empfindlichkeit bieten (Abb. 1A). Sensoren, die den 5-HT6-Rezeptor enthalten, ergaben eine vergleichbar gute Lokalisierung wie Arl13b-gekoppelte Sonden; wie jedoch weiter unten erörtert wird, verursachten 5-HT6-Rezeptoren, die nicht an Zilien lokalisiert sind, eine Erhöhung des zellulären cAMP aufgrund der bekannten konstitutiven Aktivität dieses GPCR (28).
cAMP-Signalisierung in Zilien von Digitonin-permeabilisierten Zellen. Alle Experimente wurden in intrazellulär-ähnlichem Puffer mit ATP und GTP durchgeführt. (A) mIMCD3-Zellen, die 5-HT6-mCherry und Arl13b-H187 exprimieren, die sowohl in der Zelle als auch im Cilium lokalisiert sind, reagierten weder im Zellkörper noch im Cilium auf 10 µM 5-HT nach 2 Minuten Behandlung mit 20 μg/mL Digitonin (4 Experimente, 5 Cilien). (B) In ähnlicher Weise gingen die Reaktion auf den inversen Agonisten 1 µM SB742457 und die anschließende 5-HT6-Rebound-Reaktion sowohl in der Zelle als auch im Cilium nach 2 Minuten Behandlung mit 20 μg/mL Digitonin verloren (3 Experimente, 3 Cilien). (C) Digitonin-Permeabilisierung löschte das 50 µM Forskolin-induzierte cAMP-Signal in den Zellkörpern, aber der cAMP-Anstieg war in den Zilien nachweisbar; 1 mM IBMX-induzierte PDE-Inhibition demaskierte kein Signal (n = 4 Experimente mit 4 Zilien/7 Zellen). (D) Die AC3-Cotransfektion veränderte die Forskolin-Reaktion nicht. (E) Quantifizierung und Vergleich der cAMP-Antwort auf Forskolin in Zellkörpern und in Zilien; **P = 0,0002, ***P = 00019. Blaue Spuren = Zellkörper, rote Spuren = Flimmerhärchen. Zeitbalken: 3 min. Die y-Achse ist das Verhältnis 480/535 nm.
Eine offensichtliche Erklärung für das Ausbleiben der Wirkung in den vorangegangenen Experimenten war, dass sich cAMP nicht ausreichend anreicherte, um vom Reporter erfasst zu werden. Als jedoch dasselbe Experiment unter Verwendung von Forskolin zur direkten Aktivierung endogener ACs (Adenylylzyklasen), die in der Ziliarmembran vorhanden sind, wiederholt wurde, wurde eine geringe, aber konsistente Anhäufung von cAMP in der Mikroumgebung des Ziliums, aber nicht im Zellkörper festgestellt (Abb. 4 C und E, linke Balkendiagramme). Ähnliche Ergebnisse wurden in Zellen erzielt, die AC3 (36) exprimierten (Abb. 4 D und E, rechte Balkendiagramme), das in mIMCD3-Zellen in den Zilien lokalisiert war (SI-Anhang, Abb. S8). Unter der Annahme, dass die Permeabilisierung nicht zum Verlust wesentlicher Komponenten der GPCR-Signalmaschinerie geführt hat, lässt die geringe, aber nachweisbare Veränderung nach der Zugabe von Forskolin vermuten, dass es möglich gewesen wäre, GPCR-abhängige cAMP-Signale aufzulösen, wenn sie im Zilium stattgefunden hätten. Diese Daten deuten auch darauf hin, dass die Ziliarmembran von mIMCD3-Zellen nach der Digitonin-Behandlung intakt blieb.
Die vorangegangenen Daten werfen die Frage auf, warum GPCRs nicht in der Lage sind, cAMP zu produzieren, wenn sie im Zilium sequestriert sind. Frühere Studien haben den Ca2+-Eintritt durch die Zilienmembran als einen wichtigen Regulator von Organellen-CAMP genannt, was auf das Vorhandensein von zilienspezifischen Ca2+-leitenden Kanälen (PKD2L1 und PKD2) und Ca2+-regulierten ACs (AC1, 8, 5 und 6) zurückzuführen ist (11, 16, 23, 32, 37). Es wurde berichtet, dass primäre Zilien von mIMCD3-Zellen die Ca2+-inhibierbaren AC5 und/oder AC6 beherbergen (10). Wir gingen daher davon aus, dass die hohe Ruhe- und Ca2+-Permeabilität des Ziliums (38, 39) für die Inaktivierung der an den 5-HT6-Rezeptor gekoppelten ACs verantwortlich sein könnte. Um diesen Punkt zu klären, haben wir den Sensor verbessert, indem wir die Arl13b-Zielsequenz durch einen funktionellen 5-HT6-Rezeptor ersetzt haben, um die cAMP-Reporter-GPCR-Fusion direkt auf das Zilium zu richten (5-HT6-EpacH187). In Übereinstimmung mit den Daten aus Abb. 3I und 4C ergab 5-HT, wenn es ausschließlich auf das Zilium gerichtet war, kein messbares cAMP-Signal (Abb. 5A). Die Exposition der Zellen gegenüber nominell Ca2+-freien Lösungen rettete die 5-HT-Reaktion in den Zilien nicht (Abb. 5B), was darauf hindeutet, dass der Ca2+-Eintrag durch die Zilienmembran das Signal nicht unterdrückte. Wir vermuteten, dass die Expression von 5-HT6 möglicherweise die ziliare Verteilung des Gαs-Proteins in mIMCD3-Zellen veränderte, aber Immunfärbungsexperimente deuteten darauf hin, dass dies nicht der Fall ist (SI-Anhang, Abb. S9). Als wir jedoch die Wirkung von 5-HT in Zellen testeten, die mit SAG (250 nM bis 1 µM) vorbehandelt wurden, um Smo-Rezeptoren zu aktivieren (40), konnten wir die Empfindlichkeit des 5-HT6-Rezeptors auf den Agonisten wiederherstellen (Abb. 5C). Auch die Empfindlichkeit gegenüber dem inversen Agonisten war offensichtlich, was auf die Wiederherstellung der konstitutiven Aktivität hindeutet (Abb. 5D).
Die Aktivierung des Hedgehog-Wegs erhöht die von 5-HT6-Epac-H187 gemeldete cAMP-Reaktion auf 5-HT und Dopamin in primären Zilien: (A) In Übereinstimmung mit den Daten in Abb. 3I und 4C reagierten mIMCD3-Zellen nicht auf 10 µM 5-HT, wenn die Sensor/Rezeptor-Fusion streng auf die Zilienmembran beschränkt war (6 Experimente, 6 Zilien). (B) Die Abschwächung des Hochs in den Zilien durch Einbringen der Zellen in eine nominell Ca2+-freie Lösung rettete die 5-HT-stimulierte cAMP-Signalisierung nicht (5 Experimente, 6 Zilien). (C) Nach einer Vorbehandlung mit 1 µM SAG über Nacht reagierten 5 von 6 Zilien (6 Experimente) auf eine 5-HT-Stimulation (**P = 0,000992). (D) Die Vorbehandlung mit 1 µM SAG rettete die Reaktion auf 1 µM SB742257 (-35,5 ± 11,2 % unter dem Ausgangswert im Vergleich zum anschließenden cAMP-Anstieg, der durch 10 µM 5-HT ausgelöst wurde; typisch für 4 Experimente, 4 Zilien). (E) Ein cAMP-Anstieg in NIH 3T3-Zilien (typisch für 9 Experimente, 11 Zilien) wurde durch 10 μM 5-HT verursacht. (F) Eine Vorbehandlung mit 1 μM SAG über Nacht erhöhte die 5-HT-Antwort signifikant (**P = 0,00034; 6 Experimente, 7 Zilien). Die Vorbehandlung über Nacht mit 10 μM Cyclopamin (Cyclo) hatte eine vernachlässigbare Wirkung (8 Experimente, 9 Zilien, Balkendiagramm). (G und H) 100 nM Somatostatin (SST) dämpften die 5-HT-Antwort in Zilien, die SSTR3-GFP tragen, mit und ohne SAG-Vorbehandlung (G: 5 Experimente, 6 Zilien; H: 2 Experimente, 5 Zilien). (I und J) Die SAG-Vorbehandlung erhöhte die 10 nM Dopamin (DA)-Reaktion (I: 4 Experimente, 4 Zilien, J: 4 Experimente, 6 Zilien, **P = 0,002476). Blaue Spuren, Zellkörper; rote Spuren, Zilien. Zeitbalken: 3 min. Die y-Achse ist das 480/535 nm FRET-Verhältnis. Die Balkendiagramme zeigen die 5-HT- oder DA-Antwort als Prozentsatz der Forskolin/IBMX-Antwort; die Fehlerbalken stellen den SEM dar.
Die vorangegangenen Ergebnisse warfen die Frage auf, ob die unerwartete SAG-abhängige Hochregulierung des in mIMCD3-Zellen exprimierten 5-HT6-Rezeptors zelltyp- und/oder GPCR-spezifisch war. Im Gegensatz zu mIMCD3 führte die Stimulierung von 3T3-Zellen (Abb. 5E) und MEFs (SI-Anhang, Abb. S10A) mit 5-HT zu einer messbaren Veränderung des Verhältnisses, die jedoch nach der SAG-Behandlung signifikant verstärkt wurde (Abb. 5F und SI-Anhang, Abb. S10B). Interessanterweise hob der Glättungsrezeptor-Antagonist Cyclopamin, von dem man erwarten könnte, dass er die entgegengesetzte Wirkung von SAG hat, die 5-HT-stimulierte cAMP-Signalisierung in primären Zilien von 3T3-Zellen nicht auf (Balkendiagramm, Abb. 5F).
Mit diesem System konnten wir auch die Fähigkeit eines ziliären Gαi-gekoppelten GPCR, SSTR3, zur Umkehrung von Serotonin-stimulierten cAMP-Signalen im Zilium bewerten. Die Behandlung von 3T3-Zellen, die SSTR3-GFP und 5-HT6-H187 koexprimieren, mit Somatostatin kehrte die 5-HT-Antworten innerhalb von 2 Minuten in Gegenwart und Abwesenheit einer SAG-Behandlung auf den Ausgangswert zurück (Abb. 5 G und H), was auf eine lokale Kontrolle der 5-HT6-Funktion hinweist. Anschließend testeten wir, wie SAG die Aktivität eines anderen ziliären Gαs-gekoppelten GPCR, des Dopamin-D1R-Rezeptors, beeinflusste (5). D1R-EGFP wurde zusammen mit 5-HT6-H187 in 3T3-Zellen exprimiert, und Zellen mit Fluoreszenz nur in den Zilien wurden ausgewählt. Zehn nanomolares Dopamin erzeugte kleine, aber messbare cAMP-Signale in Kontrollzellen (Abb. 5I), und auch hier wurde das Signal nach der SAG-Behandlung signifikant verstärkt (Abb. 5J; zusammengefasst in einem Balkendiagramm).