Ergebnisse und Diskussion
Es wurde berichtet, dass die Konjugation von Spirogyra durch eine Verringerung des Stickstoffgehalts oder eine Verarmung ausgelöst wird (Grote 1977; Yamashita und Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Daher versuchten wir zunächst, die Konjugation durch Stickstoffentzug aus dem Kulturmedium auszulösen. Dies war jedoch erfolglos. Grote (1977) berichtete, dass die Konjugation in reinem anorganischem Closterium-Medium induziert wurde und dass der pH-Wert eine wichtige Rolle spielte. Obwohl wir die Algenfäden in einem Medium mit verschiedenen pH-Werten inkubierten, wurde die Konjugation nicht induziert. Auch andere Versuche, verschiedene Temperaturen und die Verarmung an verschiedenen Nährstoffen, waren erfolglos. Es wurde berichtet, dass die Konjugation bei einigen Spirogyra-Arten durch die Inkubation von Algenfäden unter Dauerbeleuchtung ausgelöst wurde (Yamashita und Sasaki 1979). Unsere Materialien zeigten jedoch keine Konjugation, selbst wenn die Fäden 2 Wochen lang ohne Stickstoffquelle unter Dauerbeleuchtung bebrütet wurden. Nach verschiedenen Versuchen gelang es uns schließlich, eine Konjugation zu erreichen, indem wir die Filamente auf einer mit APW präparierten Agarplatte bei 23°C und einem 12:12-Stunden-L-D-Zyklus 4 Tage lang bebrüteten. Während der Inkubation bildeten sich auch stäbchenförmige Rhizoide am distalen Ende der terminalen Zellen. Wenn die Fäden auf der Agarplatte im Dunkeln bebrütet wurden, wurde das Konjugationsphänomen nicht ausgelöst. Allen (1958) berichtete, dass die Konjugation durch Bebrütung auf einer Agarplatte ausgelöst wurde. Sie hielt eine Stammkultur unter Verwendung von Pringsheims Boden-Wasser-Medium (Pringsheim 1946) unter einem 16-Stunden-Licht- (kühle weiße Leuchtstoffröhre) und 8-Stunden-Dunkelregime bei etwa 20°C. Zur Paarungsinduktion wurden einige Fäden auf 1,5%igen Difco-Agar übertragen, der mit destilliertem Wasser hergestellt wurde, und bei etwa 20°C im 16:8-L-D-Zyklus bebrütet. Nach einigen Tagen Inkubation bildeten sich Zygosporen auf der Agarplatte. Obwohl sich die Lichtbedingungen und die Temperatur während der Inkubation unterschieden, war die Methode von Allen (1958) im Wesentlichen mit unserer Methode identisch. Wir analysierten weiter die Faktoren, die für die Konjugationsinduktion auf der Agarplatte verantwortlich waren, wie folgt.
Wir fragten uns, ob einige unbekannte Verunreinigungen, die im Agarpulver enthalten waren, für die Induktion der Konjugation verantwortlich waren. Wir untersuchten diese Möglichkeit mit dem folgenden Experiment. Agar-Pulver (Wako, Osaka, Japan) wurde in APW suspendiert und über Nacht bei 4°C unter Rühren aufbewahrt. Nach der Zentrifugation (185×g, 10 min) wurde das resultierende Pellet 2 Mal mit APW gewaschen und zentrifugiert. Das endgültige Agar-Pellet wurde in frischem APW suspendiert und die Platten wurden vorbereitet. Die Konjugation wurde erfolgreich auf dieser Agarplatte induziert. Wurden die Algenfäden in dem durch Waschen des Agarpulvers gewonnenen Überstand bebrütet, wurde die Konjugation überhaupt nicht induziert (Daten nicht gezeigt). Somit war die Inkubation auf der Agarplatte und nicht die lösliche Verunreinigung für die Induktion der Konjugation verantwortlich.
Da APW keine stickstoffhaltigen Chemikalien enthielt, sollte die Agarplatte keinen oder nur sehr wenig Stickstoff enthalten. Daher war es möglich, dass beide Faktoren, die Lage auf der Agarplatte und die Stickstoffverarmung, bei der Induktion synergistisch wirkten. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, bebrüteten wir die Filamente auf einer Agarplatte, die mit APW, ergänzt durch 1 mM KNO3, hergestellt wurde. Auf dieser Agarplatte wurde die Konjugation ebenfalls induziert (Abb. 1a), was darauf hindeutet, dass die Stickstoffverarmung nicht für die Induktion der Konjugation verantwortlich ist. Außerdem wurde die Konjugation induziert, wenn die Fäden auf einer Agarplatte bebrütet wurden, die mit einem Closterium-Medium hergestellt wurde, das verschiedene Nährstoffe enthielt (Abb. 1b). Diese Ergebnisse weisen eindeutig darauf hin, dass die Lage auf der Agarplatte per se ein Faktor ist, der für die Induktion der Konjugation verantwortlich ist.
Auswirkung von KNO3 und Closterium-Medium auf den Beginn der Konjugation auf der Agarplatte. Etwa 100 Filamente wurden auf Agarplatten bebrütet, die mit APW, APW ergänzt mit 1 mM KNO3 oder Closterium-Medium bei 23°C unter einem 12:12 h L-D-Zyklus für 4 Tage hergestellt wurden. Wenn eine Papille beobachtet wurde, konnte man davon ausgehen, dass die Zelle mit der Konjugation begonnen hatte. Die Ergebnisse wurden als Verhältnis zwischen den Filamenten, die mit der Bildung der Konjugationsröhre begonnen hatten, und der Gesamtzahl der Filamente dargestellt. Die Experimente wurden dreimal wiederholt, und die Daten werden als Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts (SEM)
Die Induktion der Konjugation auf der Agarplatte wurde bei einer anderen Art, S.fuluviatilis, untersucht, die beim Durchschneiden der Algenfäden ein Rhizoid ausbildete (Daten nicht gezeigt), wie im Fall von S. castanacea. Bei dieser Art wurde die Konjugation auch durch die Bebrütung einer mit APW hergestellten Agarplatte ausgelöst. Wir untersuchten die Konjugation auf Agarplatten auch bei drei Spirogyra-Arten, die keine Rhizoide ausbilden. S.ellipsospora Transeau wurde im Labor als Kontaminante der Chara-Kultur gehalten. Zwei weitere Spirogyra sp. aus dem Biwa-See wurden 6 Monate lang als axenische Kultur gehalten. Alle drei Spirogyra-Arten zeigten bei der Bebrütung auf Agarplatten keine Konjugation.
Bei einigen Spirogyra-Arten wurde die Konjugation durch eine Verringerung oder Erschöpfung des Stickstoffgehalts ausgelöst (Grote 1977; Yamashita und Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Zusätzlich zum Stickstoffgehalt musste bei S. majuscule auch die Lichtintensität und/oder der pH-Wert kontrolliert werden (Grote 1977). Bei S. castanacea und S. fuluviatilis erwies sich die Bebrütung auf der Agarplatte als wirksam, und eine Stickstoffverarmung war nicht erforderlich (vorliegende Studie). Andererseits berichteten Agrawal und Singh (2002), dass Spirogyra sp. auf einer 2-10%igen Agarplatte keine Konjugation begann. Dies entsprach unseren Ergebnissen bei Spirogyra sp., die keine Rhizoiddifferenzierung vornahm. Die Faktoren, die für die Induktion der Konjugation erforderlich sind, sind also bei den Spirogyra-Arten sehr unterschiedlich. Wir fragten uns, ob die Wachstumshemmung für die Induktion der Konjugation auf der Agarplatte verantwortlich war. Während der Inkubation auf Agarplatten, die entweder mit APW- oder Closterium-Medium hergestellt wurden, vermehrten sich die Zellen durch Zellteilung auf beiden Agarplatten, wenn die Zellen nicht mit der Bildung der Papille der Konjugationsröhre begannen. Somit war die Wachstumshemmung kein Auslöser für die Konjugation.
Um das Vorhandensein eines Paarungstyps zwischen Filamenten zu untersuchen, wurde eine monoklonale Kultur von S. castanacea der Induktion der Konjugation unterzogen. Nach 48 Stunden Inkubation wurden zwei Arten der Konjugation im selben Filament gefunden (Abb. 2a-c). Abbildung 2b zeigt Zellen, die eine skalariforme Konjugation induzieren (Pfeilspitze in Abb. 2a). Abb. 2c hingegen zeigt die von den Zellen induzierte laterale Konjugation (Pfeil in Abb. 2a). Nach der lateralen Konjugation wurden normalerweise Zygosporen gebildet (Abb. 2d). Yamagishi (1977) berichtete, dass die skalariforme Konjugation im Allgemeinen beobachtet wird, während die laterale Konjugation bei S. castanacea selten ist. Unsere Ergebnisse stimmen mit denen von Yamagishi (1977) überein. Nach unserem Kenntnisstand ist die Induktion sowohl skalarförmiger als auch lateraler Konjugationen in ein und demselben Filament (Abb. 2a) jedoch der erste Bericht. Wenn sich zwei Filamente paarten, verhielten sich in den meisten Fällen alle Zellen des einen Filaments männlich und die des anderen Filaments weiblich. Sehr selten jedoch wurden Zygosporen in beiden Filamenten gebildet (Abb. 3). Der Paarungstyp ist also zumindest bei S. castanacea nicht festgelegt. Die Hypnozygote wurde durch Bebrütung auf der Agarplatte für etwa 1 Monat gebildet. Es war jedoch schwierig, die Keimung durch Zugabe von Closterium-Medium reproduzierbar auszulösen. Es muss eine Methode zur reproduzierbaren Keimung gefunden werden.
Induktion von sowohl skalariformen als auch lateralen Konjugationen im selben Filament. a Sowohl skalariforme als auch laterale Konjugationen wurden nach 48 Stunden Inkubation im selben Filament gebildet. b Höhere Vergrößerung der Zellen, die die skalariforme Konjugation in a zeigen (Pfeilspitze). c Höhere Vergrößerung der Zellen, die die laterale Konjugation in a zeigen (Pfeil). d Durch laterale Konjugation gebildete Zygosporen nach 96 Stunden Inkubation. Balken 50 μm
Konjugation in Klonkultur. Nach 96 Stunden Inkubation auf einer Agarplatte wurden Zygoten gebildet. Zygosporen wurden in beiden Filamenten gebildet. Balken 50 μm
Wir untersuchten die Identifizierung von extrazellulären Materialien, die während des Paarungsprozesses abgesondert werden, anhand verschiedener Lektine in S. castanacea. Von den 19 untersuchten Lektinen (BSL-I, BSL-II, Con A, DBA, DSL, ECL, jacalin, LEL, PHA-E, PHA-L, PNA, PSA, RCA I, SBA, SJA, STL, UEA I, VVL und WGA) färbten BSL-1, Con A, jacalin, RCA-I und SBA die reproduktiven Zellen an, nicht aber die vegetativen Zellen (Tabelle 1). Yoon et al. (2009) berichteten, dass drei Lektine, Con A, RCA und UEA, eine beträchtliche Markierung auf extrazellulären Materialien in S. varians (Hassall) Kützing zeigten. Die während der Konjugation ausgeschiedenen Lektin-bindenden Materialien scheinen sich also in gewissem Maße von Art zu Art zu unterscheiden. Wir haben bereits berichtet, dass BSL-I und Jacalin unterschiedliche Färbemuster im Rhizoid zeigen: Jacalin färbt deutlich die Umrisse des Rhizoids an, während die Färbung mit BSL-I diffus ist (Inoue et al. 1999, Ikegaya et al. 2008b). Es wurde vermutet, dass das BSL-I-bindende Material für die Adhäsion der Filamente an das Substrat verantwortlich ist. Andererseits wurde spekuliert, dass das Jacalin-bindende Material an der Erkennung des Substrats beteiligt ist (Ikegaya et al. 2008b). In der vorliegenden Studie konzentrierten wir uns daher auf BSL-I und Jacalin (Abb. 4). Nach 48 Stunden Inkubation auf einer Agarplatte bildete sich ein in Abb. 4a gezeigter Faden, der in verschiedene Richtungen Papillen bildete. Es wurde vermutet, dass dieses Filament die Bildung von Papillen in Abwesenheit des Partnerfilaments in Gang setzte. BSL-I färbte die Oberfläche der Papillen stark an. Die Septen zwischen den Zellen waren ebenfalls stark angefärbt. Als nächstes färbten wir ein Filamentpaar an, das nach 48 Stunden Inkubation mit der Konjugation begonnen hatte. In Abb. 4b wurde festgestellt, dass es sich bei dem oberen Filament um eine männliche Gamete und bei dem unteren um eine weibliche Gamete handelt, da der Durchmesser der unteren Zellen des Filaments größer ist als der des oberen Filaments. Die aus den gepaarten Zellen hervorgegangenen Konjugationsröhren waren stark gefärbt, während die gesamte Zelloberfläche der weiblichen Gamete nur schwach gefärbt war (Abb. 4b′). Nach 72 Stunden Inkubation war die gesamte Zelloberfläche der männlichen Gamete ebenfalls schwach gefärbt (Abb. 4c′). Nach 96 Stunden Inkubation auf einer Agarplatte wurden Zygosporen gebildet (Abb. 4d). Die Konjugationsröhren waren stark gefärbt (Abb. 4d′), während die Oberfläche der Zygosporen nicht gefärbt war. Als nächstes wurde die Anfärbung mit Jacalin untersucht. Die Zellen der Filamente in Abb. 3e bildeten Papillen in der gleichen Richtung. Wir vermuteten, dass dieses Filament in Anwesenheit eines Partnerfilaments mit der Konjugation begann und während des Transfers auf das Objektträgerglas verloren ging. Die Papillen waren stark mit Jacalin gefärbt (Abb. 4e′). Während des gesamten Konjugationsprozesses färbte Jacalin hauptsächlich die Konjugationskanäle (Abb. 4f′-h′). Das Färbemuster mit Con A, RCA-I und SBA wurde ebenfalls untersucht (Daten nicht gezeigt). Con A färbte die Septen zwischen den in der weiblichen Gamete gebildeten Zygosporen stark an, während die Papillen nur sehr schwach gefärbt waren. Wenn Zygosporen gebildet wurden, war das Muster der Färbung mit RCA-I oder SBA ähnlich wie das von BSL-I, wie in Abb. 4d′ gezeigt.
Tabelle 1
Untersuchung verschiedener Lektine auf Bindung an vegetative und reproduktive Zellen von Spirogyracastanacea
| Lektine | Vegetative Zellen | Reproduktive Zellen | Spezifität |
|---|---|---|---|
| BSL-I | × | ○ | Gal α, GalNAc α |
| Con A | × | ○ | Man α, Glc α |
| Jacalin | × | ○ | Sialyl-Gal β1-3 GalNAc-O- |
| RCA I | × | ○ | Gal, GalNAc |
| SBA | × | ○ | GalNAc |
| WGA | × | × | (GlcNAc)n, Sialinsäure |
Zellen wurden angefärbt (○), überhaupt nicht angefärbt (×)
Filamente im Prozess der sexuellen Reproduktion mit BSL-I und Jacalin. Die auf einer Agarplatte inkubierten Filamente wurden entweder mit Fluorescein-markiertem BSL-I oder Jacalin (a′-h′) gefärbt. Es werden auch Hellfeld-Mikrofotografien gezeigt (a-h). a′-d′ Färbung mit BSL-I. Nach 48 Stunden Inkubation auf dem Agar bildeten sich Papillen in verschiedenen Richtungen (a, a′) oder Filamente begannen zu konjugieren (b, b′). Konjugierte Filamente nach 72 Stunden Inkubation (c, c′). Nach 96 h Inkubation wurden Zygoten gebildet (d, d′). e′-h′-Färbung mit Jacalin. Nach 48 Stunden Inkubation auf dem Agar bildeten sich Papillen in derselben Richtung (e, e′), oder die Filamente begannen zu konjugieren (f, f′). Konjugierte Filamente nach 72 Stunden Inkubation (g, g′). Nach 96 Stunden Inkubation wurden Zygoten gebildet (d, d′). Balken 50 μm
Wir untersuchen die Wirkung von sechs Lektinen, BSL-I, Con A, Jacalin, RCA-I, SBA und WGA, auf die Konjugation. Die Filamente wurden einen Tag lang in APW, das mit einem der Lektine versetzt war, vorinkubiert. Dann wurden sie auf eine mit demselben Lektin angereicherte Agarplatte übertragen und 4 Tage lang bebrütet. Es wurde festgestellt, dass Jacalin die Bildung von Zygosporen stark hemmte, andere jedoch nicht (Daten nicht gezeigt). Die systematische Analyse zeigte, dass Jacalin den ersten Schritt, den Beginn der Papillenbildung, stark hemmte (Abb. 5). Als nächstes wurde die Reversibilität der Hemmung durch Jacalin untersucht. Die Filamente wurden nacheinander einen Tag lang in mit Jacalin angereichertem APW und anschließend einen Tag lang in jacalinfreiem APW inkubiert. Anschließend wurden sie 4 Tage lang auf einer Agarplatte ohne Jacalin bebrütet. Es wurden jedoch keine Papillen gebildet. Diese irreversible Hemmung könnte auf die starke Bindung von Jacalin zurückzuführen sein. Yoon et al. (2009) berichteten, dass RCA und UEA die Konjugation hemmen. Sie konnten jedoch den Schritt der Hemmung nicht identifizieren. BSL-I, RCA-I, Con A und SBA färbten zwar auch die Konjugationsröhre an, hemmten aber nicht deren Bildung. Die Rolle der Materialien, die entweder von BSL-I, RCA-I oder SBA erkannt werden, ist das Ziel zukünftiger Studien.
Wirkung der Lektine auf den Beginn der Konjugationsröhrenbildung. Etwa 100 Filamente wurden in APW inkubiert, das entweder mit 1 μg/ml BSL-I, Con A, Jacalin, RCA-I, SBA oder WGA bei 23°C unter einem 12:12 h L-D-Zyklus für 1 Tag ergänzt wurde, und dann wurden sie auf eine Agarplatte übertragen, die mit demselben Lektin ergänzt wurde, und für 4 Tage inkubiert. Wenn eine Papille beobachtet wurde, konnte man davon ausgehen, dass die Zelle mit der Konjugation begonnen hatte. Die Ergebnisse wurden als Verhältnis zwischen den Filamenten, die mit der Bildung der Konjugationsröhre begonnen hatten, und der Gesamtzahl der Filamente dargestellt. Die Experimente wurden viermal wiederholt, und die Daten sind als Mittelwert und SEM angegeben
Randhawa (1959) vermutete eine Ähnlichkeit zwischen den Konjugationsprozessen und der Rhizoidbildung: ein Kontaktreiz ist beteiligt. Kniep (1928) hingegen glaubte, dass die Konjugationsprozesse im Wesentlichen auf einen chemischen Reiz zurückzuführen seien (zitiert in Randhawa (1959)). Sowohl die Konjugationsröhre als auch das Rhizoid beginnen mit der Bildung einer Papille und können sich durch Spitzenwachstum verlängern. Die Konjugationsröhre wird jedoch an der Flanke gebildet, während das Rhizoid am distalen Ende der Zelle entsteht (Nagata 1973). Jacalin färbte die Umrisse sowohl der Konjugationsröhre (Abb. 3e′-h′) als auch des Rhizoids deutlich an (Ikegaya et al. 2008b). Jacalin hemmte die Bildung von Rhizoiden nicht, wohl aber die Differenzierung zu rosettenförmigen Rhizoiden (Ikegaya et al. 2008b). Im Falle der Konjugationsröhren hemmte Jacalin jedoch die Bildung der Papille an sich (Abb. 5). Es scheint, dass die Rolle des Jacalin-bindenden Materials in der Konjugationsröhre und im Rhizoid unterschiedlich ist.
Der Erfolg bei der reproduzierbaren Induktion der Konjugation im Labor öffnete den Weg für systematische Analysen der Konjugation in Spirogyra, wie z.B. die Bestimmung des Mechanismus der Sexualität der Zellen, der Rolle des Lektin-bindenden Materials und des Bewegungsmechanismus des männlichen Protoplasten.