Bei den meisten IHC/ICC-Verfahren werden Gewebe und Zellen mit Fixiermitteln auf Formaldehydbasis fixiert. Das folgende Protokoll beschreibt die Technik zur Herstellung einer 4%igen Formaldehydlösung in PBS. Das wirksamste Fixiermittel muss experimentell ermittelt werden.
Vorsicht: Formaldehyd ist giftig. Bitte lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt, bevor Sie mit dieser Chemikalie arbeiten. Handschuhe und Schutzbrille sollten getragen und die Lösungen in einem Abzug hergestellt werden.
Bitte lesen Sie das Protokoll vollständig durch, bevor Sie beginnen.
Benötigte Reagenzien
- Deionisiertes H2O
- HCl (verdünnt)
- NaOH (1 N)
- Paraformaldehydpulver
- 1X PBS: 0,145 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0081 M Na2HPO4, 0,0015 M KH2PO4, pH 7.4
Materialien
- Filtereinheiten
- Gläser und Rührstab (speziell für Formaldehydlösung)
- Handschuhe und Augenschutz
- Heizplatte mit Magnetrührer
- Thermometer
- Lüftungshaube
Vorgehensweise
- Für 1 L 4% Formaldehyd, 800 mL 1X PBS in ein Becherglas auf einer Rührplatte in einer belüfteten Haube geben. Unter Rühren auf etwa 60 °C erhitzen. Achten Sie darauf, dass die Lösung nicht kocht.
- Geben Sie 40 g Paraformaldehyd-Pulver in die erhitzte PBS-Lösung.
- Das Pulver löst sich nicht sofort in der Lösung auf. Erhöhen Sie langsam den pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 1 N NaOH mit einer Pipette, bis die Lösung klar wird.
- Wenn das Paraformaldehyd gelöst ist, sollte die Lösung abgekühlt und filtriert werden.
- Das Volumen der Lösung mit 1X PBS auf 1 L einstellen.
- Überprüfen Sie den pH-Wert und stellen Sie ihn mit kleinen Mengen verdünnter HCl auf etwa 6 ein.9.
- Die Lösung kann aliquotiert und eingefroren oder bei 2-8 °C bis zu einem Monat aufbewahrt werden.
Der Unterschied zwischen Paraformaldehyd, Formaldehyd und Formalin
Paraformaldehyd (chemischer Name: Polyoxymethylen) ist ein Pulver aus polymerisiertem Formaldehyd, das von sich aus keine Gewebe fixieren kann. Um als Gewebefixierungsmittel verwendet werden zu können, muss Paraformaldehyd in heißem Wasser aufgelöst werden, um eine Formaldehydlösung zu erhalten. Formalin ist eine gesättigte Formaldehydlösung in Wasser (37 Gew.-%, 40 Vol.-%) mit 10-15 % Methanol. Methanol wird zugesetzt, um die Polymerisation zu Formaldehyd zu verlangsamen, was die Fixierkraft von Formalin verringert. Formalin kann auch in alkoholfreier Form aus pulverisiertem Paraformaldehyd hergestellt werden.