12.9.2 Cross-linking
Näennäisistä eduista huolimatta biologisten telineiden käyttöön liittyy edelleen useita ongelmia, erityisesti niiden nopea biologinen hajoaminen in vivo, immunogeenisuuteen liittyvät huolenaiheet sekä tahattomat tai epätäydelliset kudosreaktiot. Näiden huolenaiheiden ratkaisemiseksi on vuosikymmenien aikana käytetty ristisilloitusmenetelmiä. Ristisilloituksella hidastetaan biologista hajoamista sekä eliminoidaan tai vähennetään ECM-telineiden rakenneproteiineihin kohdistuvia ristikkäisreaktioita (Courtman ym., 2001).
Ristisilloituksen onnistumista voidaan arvostaa kehitettäessä bioproteesisia sydänläppiä ksenogeenisistä kudoksista. Siirtymistä formaldehydikäsittelystä ja bioproteettisten sydänläppien glutaraldehydin ristisilloittamisen käyttöönottoa pidetään merkittävänä saavutuksena tällä alalla (Zilla et al., 2007). Ristisilloitus säilyttää bioproteesisten sydänläppien trombogeenittoman pinnan, vähentää antigeenisyyttä ja estää hajoamista, mikä pidentää niiden elinikää in vivo. Tätä bioproteettisen sydänläpän kiinnitysmuotoa käytetään edelleen. Kollageenin kromiparkitusta on käytetty jo yli 100 vuoden ajan eläinten nahkojen säilömiseen nahkateollisuudessa (Covington, 1997). Prosessissa kromilajien ja kollageenin välille syntyy ionisia, kovalenttisia ja vetysidoksia. Tätä biomateriaalin stabiloinnin muotoa on hyödynnetty myös kromikatgutin valmistuksessa kirurgisiksi ompelumateriaaleiksi (Van Winkle et al., 1975). On olemassa useita muita ristisilloitusaineiden muotoja, jotka on pääasiassa kehitetty tarpeesta parantaa bioproteesisten sydänläppien ja sydänpussikudoksen suorituskykyä in vivo ja voittaa kalkkeutumiseen ja sytotoksisuuteen liittyvät puutteet. Ristisilloitusaineet vaihtelevat tunnetuista aldehydeistä (formaldehydi ja glutaraldehydi) uudempiin bifunktionaalisiin ristisilloitusaineisiin, kuten polyepoksiyhdisteisiin ja heksametyleenidiisosyanaattiin. Muita nykyaikaisia silloitusaineita ovat nollapituiset silloitusaineet, kuten asyyliatsidi ja karbodiimidit (Khor, 1997). Vaikka glutaraldehydin ristisilloittamista käytetään edelleen biologisten telineiden stabiloimiseen, kehitetään uusia toiminnallisia ja mahdollisesti vähemmän sytotoksisia ristisilloitusmenetelmiä. Näihin kuuluvat mikrobiologinen transglutaminaasientsyymi, kasviperäinen yhdiste genipiini ja monitoiminen dendriimeerinen ristisilloitus (Garcia ym., 2007b; Duan ym., 2007; Chang ym., 2002; Chan ym., 2007),
Tässä vaiheessa on siirrytty käyttämään bioproteeseja, jotka eivät ole hajoavia ja joiden on tarkoitus kestää yli potilaan eliniän, ja siirrytään biohajoaviin telineisiin, jotka on suunniteltu muokkautumaan in vivo ajan mittaan vaurioituneiden tai sairaiden elinten korjaamiseksi (Brody ja Pandit, 2007; Badylak, 2007). Telineen hajoamisen olisi oltava hallittua ja tapahduttava samanaikaisesti, jotta se vastaisi kudoksen regeneraationopeutta in vivo (Burugapalli et al., 2007). Kudosteknologiassa käytettävän biohajoavan telineen on myös huolehdittava tarvittavasta toiminnasta, kunnes uusi kudos voi ottaa tämän tehtävän hoitaakseen. Idealisoidussa biohajoavassa telineessä isäntäsolujen tunkeutuessa ja asuttaessa istutettua telineen ne erittävät uutta solunulkoista matriksia alkuperäisen telineen tilalle, joka hajoaa ennalta määrätyllä nopeudella.
On osoitettu, että biologisen telineen in vitro- ja in vivo -hajoamisnopeutta voidaan räätälöidä ristisilloittumisasteella (Burugapalli et al., 2007). Liang et al. (2004) tutkivat ristisilloituksen asteen vaikutusta kudosvasteeseen ja regeneraatiomalliin käyttämällä naudan akellulaarista perikardiumia, joka oli ristisilloitettu genipiinillä. He havaitsivat rotan ihonalaisessa implantointimallissa, että ristisilloittamaton ja minimaalisesti ristisilloitettu naudan akellulaarinen sydänperikardium hajosi nopeasti ennen kuin uutta kudosta saattoi muodostua. Sitä vastoin kohtalaisesti ristisilloitetussa ja erittäin ristisilloitetussa telineessä havaittiin uusia kollageenimuodostumia, vaikkakin jälkimmäisessä tämä prosessi rajoittui telineen uloimpaan kerrokseen, koska sen kyky vastustaa hajoamista oli parempi. Kun samankaltaisia telineitä istutettiin verisuonilaastariksi koiraeläinmalliin (Chang ym., 2004), siirteen sisäpinnalla havaittiin ehjä endoteelikerros sekä isännän fibroblastit ja sileät lihassolut akellulaarisessa siirteessä. Näin tapahtui vähäisemmässä määrin tutkimuksessa käytetyssä glutaraldehydillä ristisilloitetussa naudan akellulaarisessa perikardiumissa. Molemmissa telineissä havaittiin kuitenkin tahatonta intiman paksuuntumista ja kondroidien metaplasiaa. Toisessa tutkimuksessa samanlaista genipiinillä ristisilloitettua naudan akellulaarista perikardiaa käytettiin sydänvikojen korjaamiseen rotan oikean kammion mallissa (Chang ym., 2005). Endokardiaalipinnalla havaittiin endoteelisolujen peittämää intimapaksuntaa. Mesoteelisoluja havaittiin myös siirteen ulkopinnoilla, joiden ajatellaan vastustavan adheesiota. Telineen sisällä havaittiin sileälihassoluja, neomuskelikuituja, neokollageenia, neoglykosaminoglykaaneja ja neokapillaareja neljä viikkoa istutuksen jälkeen.
Gelatiinia on käytetty biomateriaalina perifeeristen hermopuutosten korjaamiseen (Mligiliche ym., 1999; Gamez ym., 2004). Gelatiinista valmistettuja ja genipiinillä ristisilloitettuja hajoavia telineitä käytettiin täyttömateriaalina putkimaiseen piikammioon, ja ne toimivat solunulkoisena matriisina ohjaamaan hermon regeneraatiota 10 mm:n iskiashermovälin yli rotilla (Liu ym., 2004). Osoitettiin, että täytteen jäännös esti aksonien migraatiota ja pidentymistä (Verdu ym., 2002), ja tämän arveltiin johtuvan gelatiinitäytteen pidentyneestä hajoamisajasta (Bigi ym., 2002; Liu ym., 2004). Kun ristisilloitettua gelatiinia käytettiin putkijohtimena (eikä täytemateriaalina) samankaltaisten hermorakojen siltana, uudistuneita hermosäikeitä, jotka sisälsivät enimmäkseen myelinisoitumattomia aksoneja ympäröivine Schwannin soluineen, löytyi raon poikki kuuden viikon kuluttua, kun johtimen hajoaminen alkoi ja neovaskularisaatio lisääntyi (Chen ym., 2005). Uudistuneen hermon ulkoalueella oli myös tiheää arpikudosta. Ohut kerros kuitukapselia havaittiin ihonalaisen implantoinnin jälkeen yhdessä odotettavissa olevien akuuttien ja kroonisten tulehdusreaktioiden kanssa.
Ristisilloitetun konsentraation havaittiin sanelevan in vivo hajoamisen, kun ristisilloitetut gelatiini-tralsumifosfaattitelineet implantoitiin ihon alle (Yao ym., 2004). Vähemmän ristisilloitettuun telineeseen liittyi suurempi hajoaminen, kun taas hyvin ristisilloitettuun telineeseen liittyi minimaalinen in vivo -hajoaminen. Suurempien ristisilloitettujen määrien käyttöön liittyi myös lisääntynyttä implantin kuitukapselin muodostumista, jonka katsottiin johtuvan ristisilloitetun sytotoksisuudesta. Kun samanlaisia telineitä implantoitiin korjaamaan kanien calvariaalisia luuvikoja, kirjoittajat havaitsivat, että telineet hajosivat vähitellen ja korvautuivat uudella luulla, vaikka tämä prosessi rajoittui vain luun ja telineen rajapintaan (Yao ym., 2005). Sama glutaraldehydillä ristisilloitettu komposiitti sai aikaan samanlaisen vasteen (Chen ym., 1998). Komposiittitelineet hajosivat asteittain ajan mittaan, kun uusi luu korvasi telineet ja akellulaarinen matriisi kerrostui defektin reunasta sentripetaalisesti. Vaikka suunniteltu teline voi olla ratkaisevan tärkeä, muut tekijät voivat nopeuttaa paranemisprosessia. Esimerkiksi ylipainehappihoidon lisääminen lisäsi huomattavasti uuden luun muodostumista, kuten radiologiset ja histomorfometriset menetelmät osoittivat (Chen ym., 2004). Bioaktiivisten tekijöiden, kuten BMP-2:n, läsnäolo hajoavassa telineessä aiheutti ektooppista luunmuodostusta ihon alla ja lihaksensisäisesti ja näytti kiihdyttävän resorptiota osteoklastien toiminnan vuoksi (Liang ym., 2005; Takahashi ym., 2005; Kato ym., 2006; Yoneda ym., 2005).