U bent op het vliegveld de tijd aan het verdoen met een verslag dat morgenochtend klaar moet zijn voor uw professor. U hebt uw gegevens. Waarom maak je geen gebruik van de tijd en bereken je niet de expressie vouwverandering voor de genen die je hebt getest in dat eerste qPCR experiment dat je vorige week hebt gedaan?
Het is gemakkelijk – ik zal je laten zien hoe.
Check Your Method
Er zijn twee belangrijke manieren om qPCR data te analyseren: dubbele delta Ct analyse en de relatieve standaard curve methode (Pfaffl methode). Beide methoden maken aannamen en hebben hun beperkingen, zodat de methode die u voor uw analyse moet gebruiken, afhangt van uw experimentele opzet.
De dubbele delta Ct-analyse gaat ervan uit dat:
- er gelijke primer-efficiëntie is tussen primersets (d.w.z. binnen 5%);
- er is bijna 100% amplificatie-efficiëntie van de referentie-en de doelgenen;
- de interne controlegenen zijn constant tot expressie en worden niet beïnvloed door de behandeling.
De methode is over het algemeen geschikt voor experimenten met een groot aantal DNA-monsters en een laag aantal genen te testen.
De relatieve standaardcurve-methode gaat ervan uit dat:
- er gelijke efficiënties zijn tussen de controlemonsters en de behandelde monsters.
Deze methode werkt beter als u minder DNA-monsters hebt, maar een groter aantal genen te testen.
Wat hebt u nodig voor Double Delta Ct Analysis
- qPCR Ct-waarden (ruwe gegevens) voor:
- het huishoudgen: controle- en experimentele condities;
- het gen van interesse: controle- en experimentele condities;
- een Excel-spreadsheet.
En dat is het! Geen dure software nodig.
Hier volgt een korte samenvatting van de belangrijkste stappen in de dubbele delta Ct analyse (voor een gedetailleerde uitleg lees dit paper).
4 Stappen voor Dubbele Delta Ct Analyse
1. Neem het gemiddelde van de Ct waarden voor het huishoudgen en het gen dat getest wordt in de experimentele en controle omstandigheden, wat 4 waarden oplevert. De 4 waarden zijn getest gen experimenteel (TE), getest gen controle (TC), huishoudgen experimenteel (HE), en huishoudgen controle (HC).
| Gemiddelde experimentele Ct-waarde | Gemiddelde experimentele Ct-waarde | Gemiddelde controle Ct-waarde | Gemiddelde controle Ct-waarde | \DeltaCt-waarde (Experimenteel) | DeltaCt-waarde (Controle) |
|---|---|---|---|---|---|
| TE | HE | TC | HC | \DeltaCTE | \DeltaCTC |
| 21.27 | 20.23 | 19.60 | 19.27 | 1.03 | 0.33 |
2. Bereken de verschillen tussen de experimentele waarden (TE – HE) en de controlewaarden (TC – HC). Dit zijn uw DeltaCt waarden voor de experimentele (DeltaCTE) en controle (DeltaCTC) omstandigheden, respectievelijk.
3. Bereken vervolgens het verschil tussen de DeltaCt waarden voor de experimentele en de controle omstandigheden (DeltaCTE – DeltaCt) om te komen tot de dubbele delta Ct waarde (ddCt).
4. Aangezien alle berekeningen in logaritmebasis 2 zijn, zullen uw Ct-waarden telkens wanneer er tweemaal zoveel DNA is, met 1 afnemen en niet halveren. Je moet de waarde van 2^{-2} Delta C_{t}} berekenen om de uitdrukking vouwverandering te krijgen.
| dCt Waarde (Experimenteel) | dCt Waarde (Controle) | ddCt Waarde | Expressie Vouwverandering |
|---|---|---|---|
| dCTE | dCTC | ddCt | 2^-ddCt |
| 1.03 | 0.33 | 0.70 | 0.615572207 |
Wat betekent de waarde?
Nu dat u uw waarde voor de vouwverandering heeft, wat betekent het eigenlijk? Deze waarde is de vouwverandering van het gen van uw interesse in de testconditie, ten opzichte van de controleconditie, die allemaal genormaliseerd zijn naar uw huishoud-gen.
Om het wat duidelijker te maken – u kunt het zien als een percentage. Een vouwverandering van 1 betekent dat er 100% evenveel genexpressie is in uw testconditie als in uw controleconditie – er is dus geen verandering tussen de experimentele groep en de controlegroep. Een vouw-veranderingswaarde boven 1 toont upregulatie van het gen van belang ten opzichte van de controle (1.2 vouw-verandering = 120% genexpressie ten opzichte van de controle, 5 = 500%, 10 = 1.000%, etc.). Waarden onder 1 zijn indicatief voor gen downregulatie ten opzichte van de controle (vouw verandering van 0.5 is 50% genexpressie ten opzichte van de controle, dus half zoveel expressie als in de controle, enz.).
U kunt deze gegevens presenteren als vouw-wissel staafdiagrammen, waarbij de controle condities gelijk aan 1 in een grafiek worden gezet. U kunt ook gebruik maken van statistische analyses om de significantie van de veranderingen te controleren, bijvoorbeeld met behulp van een analyse van variantie (ANOVA) of t-tests, wat geschikt is voor uw experimentele set-up!
Met behulp van deze stappen kunt u uw qPCR-analyse waar u ook bent, zelfs als je op een road trip. Om het nog gemakkelijker te maken, kunt u een Excel-sjabloon maken dat u elke keer gebruikt. Dan hoeft u alleen nog maar uw gegevens in te voeren en zult u anderen versteld doen staan van uw voortvarendheid bij het uitvoeren van analyses!
Oorspronkelijk gepubliceerd op 9 juli 2016. Reviewed and updated on February 8, 2021.
Further Reading
Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 2^{-2Delta C_{t}} Methode. Methods. 2001;25:402-8.
Heeft dit u geholpen? Deel het dan met uw netwerk.