Free Press

INLEIDING

Diermodellen spelen een belangrijke rol bij de ontwikkeling van geneesmiddelen en de studie van moleculair-biologische mechanismen. Historisch gezien heeft het door koolteer geïnduceerde huidkankermodel bij konijnen de aanzet gegeven tot de ontwikkeling van een door carcinogenen geïnduceerd muismodel. Verschillende diermodellen zijn opgezet als evaluatie-instrument voor de voorspelling van carcinogenen en het onderzoek van carcinogene mechanismen (1). De aanpak waarbij gebruik wordt gemaakt van chronische blootstelling aan een carcinogeen is echter tijdintensief en duur, waardoor de toepassing ervan bij de ontwikkeling van geneesmiddelen wordt beperkt. Niettemin zijn muismodellen nog steeds aantrekkelijker dan grote diermodellen wegens de lage kostprijs, de gemakkelijke hanteerbaarheid en de bekende genetische informatie (2). Meer recent is een syngeen muismodel ontwikkeld, geïnjecteerd met muriene cellijnen (3). De voordelen van dit model zijn de reproduceerbaarheid, de mogelijkheid om gemakkelijk verschillende tumortypes te induceren, en de immunocompetentie. Anderzijds vertoont dit model vaak een andere respons in vergelijking met de resultaten van in vitro proeven met menselijke kankercellen. Om dit nadeel te ondervangen heeft het National Cancer Institute (NCI) een methode gebruikt waarbij menselijke kankercellen in een immuundeficiënte muis worden geïnjecteerd. Er werd een reeks xenograft-modellen ontwikkeld op basis van acht verschillende NCI-kankercellijnen (hersenen, dikke darm, leukemie, long, melanoom, eierstokken, prostaat en nier). Daarnaast zijn er verschillende methoden ontwikkeld voor het genereren van muismodellen voor de beoordeling van de werkzaamheid en toxiciteit van nieuwe geneesmiddelen. Eén model is het genetisch gemanipuleerde muismodel (GEMM), dat een geavanceerde methode is voor de evaluatie van carcinogenesemechanismen en geneesmiddelenresistentie (4). Voor het GEMM-model worden immunocompetente muizen gebruikt, vergelijkbaar met een syngeen model. Dit model maakt dus de toepassing mogelijk van de ontwikkeling van immuunadjuvant voor kanker. Bovendien is dit model nuttig voor het ophelderen van biologische processen en het onderzoeken van tumorcellen en hun micro-omgeving, maar het is zeer duur, heterogeen en gecompliceerd. Bovendien vallen tumorfrequentie, -ontwikkeling en -groei niet samen in het GEMM-model (4-7). Veel onderzoekers hebben een strategie bedacht voor preklinische evaluatie om het therapeutisch potentieel te bepalen en de menselijke tumoromgeving na te bootsen. Naast het GEMM-model worden bij in vivo xenograft-modellen athymische naaktmuizen en ernstig gecombineerde immuundeficiëntie (SCID)-muizen gebruikt voor de implantatie van de menselijke kankercellen of tumorweefsel van patiënten in translationeel onderzoek voor klinische trials (8,9). In dit overzicht worden de soorten en kenmerken van de tumor xenograft modellen toegespitst op het gebruik bij de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen kanker.

Ectopische tumor xenograft model. In het algemeen worden menselijke kankercellen subcutaan geïnjecteerd in de achterpoot of rug van muizen (Fig. 1A). In een ectopisch tumor xenograft model (ectopisch model), is de getransplanteerde plaats verschillend van de oorsprong van de gekweekte cellen. Het ectopische model is het standaardmodel van kanker dat wordt gebruikt voor validatie en beoordeling in oncologisch onderzoek. Na de vaststelling van kankercellijnen voor antikankerscreening in het NCI werden van deze cellijnen afgeleide xenograftmodellen ontwikkeld. Zestig cellijnen afkomstig van acht organen werden gebruikt voor de vaststelling van xenograft-modellen en informatie zoals verdubbelingstijd van de tumor en tumorigeniciteitsgraad werd gerapporteerd (1). In tabel 1 was bij menselijke kankercellijnen de reproduceerbare opnamegraad van het xenograft-model meer dan 90%. Voor de evaluatie van lead compounds verkregen uit een in vitro screening test, toonde dit model aan dat dezelfde kankercellen nuttig en voorspellend kunnen zijn, wat nuttig is voor de selectie van een toepasbare kankerverbinding voor vertaling naar klinische trial.

Omdat een ectopisch model kan worden gebruikt om tumorigeniciteit en tumorgroei gemakkelijk te controleren, hebben veel onderzoekers gebruik gemaakt van dit model voor de evaluatie van antikanker werkzaamheid (10-12). Tumor volume (V) wordt berekend uit de grootste lengte en de kortste lengte van de tumor (Equation1). Uit verschillende parameters op basis van deze gegevens kan de antikankeractiviteit worden geëvalueerd. Er wordt gebruik gemaakt van de verhouding tussen de behandelde groep (T) en de controlegroep (C) (optimaal % T/C), de vertraging van de tumorgroei en de regressie van de tumor (13-15). Drug-gerelateerde sterfte (DRD) en verandering in lichaamsgewicht als parameters van toxiciteit werden bepaald. DRD was verondersteld diersterfte binnen 15 dagen, en meer dan 20% verlies van behandeld muis lichaamsgewicht in vergelijking met controle werd beschouwd als een nadelig effect.

Deze parameters helpen om de lead compound uit drug screening te trekken. Soms kan de geneesmiddelenrespons afhankelijk van het kankertype worden vergeleken zonder individuele verschillen, omdat twee soorten kankercellen spontaan in dezelfde muis kunnen worden getransplanteerd en de twee tumoren verschillen in groei kunnen vertonen (16). Bovendien is het ectopische model zeer reproduceerbaar, homogeen en goed bruikbaar.

Niet alle tumoren kunnen echter als beoordelingsinstrument worden gebruikt, omdat sommige tumoren necrose vertonen tijdens de tumorigeniciteit en sommige tumoren niet solide (niet-substantieel) zijn. De immuno-onderdrukte muizen die voor het maken van diermodellen worden gebruikt, vertegenwoordigen een ander micromilieu dan dat van kanker bij de mens. Daarom is de beoordeling van invasie en metastase in dit model beperkt.

Orthotopische tumor xenograft model. Er zijn alternatieve modellen ontwikkeld voor de beoordeling van de gevoeligheid van tumoren. Het orthotopische tumor xenograft model (orthotopisch model) is een geavanceerd instrument, maar is gebaseerd op een immunosuppressieve muizen micro-omgeving. In het orthotope model worden de menselijke kankercellen getransplanteerd naar dezelfde plaats van oorsprong van de tumor. Zo werden longkankercellen rechtstreeks geïnjecteerd in de long van de muis voor het orthotope model (Fig. 1B). In dit model is een goed opgeleide deskundige met chirurgische vaardigheden vereist om de reproduceerbaarheid te waarborgen. De snelheid van tumorigeniciteit is moeilijk te berekenen omdat bijna alle tumoren behalve melanoom onzichtbaar zijn voor het blote oog. Bovendien zijn orthotope modellen beperkt tot meting van tumorgroei zonder opoffering in tegenstelling tot subcutane ectopische modellen. Tot op heden is beeldvorming de gekozen methode om de progressie van groeiende tumoren in orthotope modellen te volgen. Momenteel worden orthotope modellen met kankercellijnen die fluorescentie of luciferase tot expressie brengen, geobserveerd door optische beeldvorming, computergestuurde tomografie (CT) of magnetische resonantie beeldvorming (MRI) (17). Om de carcinogenese te beoordelen en de tumorgroei te bepalen zonder opoffering is dure apparatuur vereist, zodat de beschikbaarheid van dit model beperkt is. Niettemin is dit model klinisch relevant voor het patiënt-achtige progressieproces (b.v. invasie). Volgens het rapport van Ho en zijn collega’s vertonen orthotope tumoren een snellere tumorgroei in een vroeg stadium, angiogenese en hyperpermeabiliteit van de bloedvaten in vergelijking met ectopische tumoren (18). Bij sommige kankertypes werd ook metastase waargenomen. Bijvoorbeeld, het orthotope mammary fat pad tumor implantaat model is ook een goed model voor borstkanker. In dit model lijken spontane tumormetastasen op de natuurlijke progressie van menselijke borstkanker (19). Daarom kunnen antikankeractiviteit en metastaseremming in hetzelfde model worden geëvalueerd. Het metastasemodel wordt hieronder in detail beschreven.

Metastatisch kankermodel. Tumoren die plaatselijk ontstaan door blootstelling aan ultraviolet, ioniserende straling en carcinogenen circuleren via invasie in vaten en lymfeklieren en veroorzaken metastase (secundaire kanker) op plaatsen die vatbaar zijn voor invasie. Volgens de “seed and soil”-hypothese van Paget initieert de primaire kankercel (seed) metastase in een geschikte omgeving (soil) zoals long, lever, bot, lymfe, en hersenen (20). Recent onderzoek heeft de ontwikkeling van metastaseremmers en preventieve geneesmiddelen gestimuleerd op basis van studies van de mechanismen van metastase, maar er is geen preklinisch evaluatie-instrument geweest om richtlijnen te definiëren voor de goedkeuring van een klinische proef.

Voor de vaststelling van een metastasemodel zijn verschillende methoden ontwikkeld en er zijn twee soorten humane xenograftmodellen. Bij orthotope transplantatie doen getransplanteerde tumorcellen de primaire tumor ontstaan, wordt de tumor verwijderd en wordt vervolgens metastasering waargenomen. Zo werden bijvoorbeeld WM239 melanoomcellen getransplanteerd in ernstig gecombineerde immuundeficiëntie (SCID)-muizen en werd de primaire tumor na 4 weken geïsoleerd. Vervolgens werd longmetastase waargenomen (21). Het orthotope model werd gemaakt van prostaatkankercellen (DU145), en de verwijderde lymfeklier werd gekweekt en geïsoleerde tumorcellen werden opnieuw in muizen geïnjecteerd om een metastasemodel te verkrijgen (22). Ten tweede werden kankercellen intraveneus geïnjecteerd in naakte (Fig. 1C) of SCID muizen, waar ze circuleerden als kankerstamcellen en metastase veroorzaakten (23). Dit model wordt sneller gegenereerd dan het eerste model. In de hybride van het ectopische en orthotopische model, worden fluorescentie-expresserende HT-29 cellen (menselijke colonkanker) subcutaan geïnjecteerd op de ectopische plaats en verschillende stukjes van HT-29 cellen afgeleide tumoren worden getransplanteerd in het colon, en vervolgens wordt metastase waargenomen (24). In het algemeen is een metastasemodel gemakkelijker te verkrijgen in SCID-muizen dan in naakte muizen. Omdat metastase, zoals in het orthotope model, moeilijk in het echt kan worden waargenomen, behalve in het geval van huidkanker (25), werden genetisch gemanipuleerde cellijnen (fluorescentie (24) of luciferase-expresserende cellen (26)) gebruikt en gevolgd met behulp van in vivo optische beeldvorming. Vaak wordt dit model toegepast voor theragnose, waarbij beeldvorming door MRI of positronemissietomografie (PET) (27) wordt gebruikt om gelijktijdig een diagnose te stellen en de juiste antikankertherapie te bepalen. Tot op heden zijn de richtlijnen voor het gebruik van metastase als een beoordelingsinstrument voor de ontwikkeling van geneesmiddelen nog niet vastgesteld. Verdere studies naar reproduceerbaarheid, mechanismen die ten grondslag liggen aan metastase, en markers zijn nodig.

Patiënt-afgeleide tumor xenograft model. Xenotransplantaatmodellen zijn, ondanks hun voordelen, beperkt in hun vermogen om aan te tonen hoe een kankerpatiënt op een bepaalde behandeling zou reageren. Er is behoefte aan een betrouwbare voorspelling van de geneesmiddelenrespons in een klinische proef, en de huidige modellen volstaan niet. In een poging om de tekortkomingen van deze modellen aan te pakken, werd een patiënt-afgeleide tumor xenograft (PDTX) ontwikkeld en gebruikt (28,29). Omdat bij PDTX weefsel van kankerpatiënten rechtstreeks in immuungecompromitteerde muizen wordt getransplanteerd (fig. 1D), zijn genetische informatie en immunohistologische markers correlatief met de patiënt en kunnen zij worden toegepast om nieuwe geneesmiddelen tegen kanker (30) en gepersonaliseerde kankertherapieën te evalueren. De verschillende voordelen van PDTX kunnen als volgt worden samengevat: 1

Het PDTX-model heeft echter technische beperkingen, en is duur en tijdrovend. Bovenal moeten vers geëxcideerde primaire menselijke tumoren binnen enkele uren van de operatiekamer naar het laboratorium worden gebracht. Tegelijkertijd moet een monster van de primaire menselijke tumoren worden onderzocht door immunohistologische analyse. Daarom is samenwerking tussen de chirurg, de histoloog en de onderzoeker noodzakelijk. Vervolgens kunnen de oorspronkelijke primaire menselijke tumoren worden vergeleken met tumorweefsels van het gepasseerde tumorgraft. Bovendien is de goedkeuring van een institutionele beoordelingsraad (IRB) vereist omdat het gebruik van tumorweefsel afkomstig van patiënten klinische en ethische overwegingen met zich meebrengt. Ondanks deze inspanningen bedraagt de penetratiegraad van PDTX ongeveer 25% (31-33), en duurt het ongeveer drie maanden tot de eerste passage (gegevens niet aangetoond). Evenals bij xeno-orgaantransplantatie is de eerste transplantatie in SCID-muizen nodig om aan acute immunorejectie te ontsnappen, en dit is duur. Bovendien is het patiënt-afgeleide tumorweefselvolume zeer beperkt, zodat het aantal PDTX-populaties moet worden verhoogd via tumorweefselpassage.Tegelijkertijd moet elke passage van tumorweefsels histopathologisch worden geanalyseerd en vergeleken met het oorspronkelijke weefsel. Vanaf de tweede passage kunnen nude muizen worden gebruikt. De stukjes tumorweefsel kunnen worden ingevroren en bewaard in vloeibare stikstof.

Ondanks deze hindernissen is het gevestigde PDTX-model beschikbaar voor de validatie van de gevoeligheid van antikankermedicijnen en de voorspelling van de prognose van de patiënt. PDTX is zeker een uiterst veelbelovend model voor gepersonaliseerde kankertherapie. Wereldwijde onderzoekscentra zijn dan ook bezig met het opzetten van een PDTX-bank. In de afgelopen tien jaar heeft het PDTX-model zich snel ontwikkeld. Dit model is een veelbelovend instrument voor de ontwikkeling van antikankergeneesmiddelen en voorspellende biomarkers.