12.9.2 Sieciowanie
Mimo oczywistych zalet, stosowanie rusztowań biologicznych nadal wiąże się z wieloma problemami, w szczególności z ich szybką biodegradacją in vivo, obawami dotyczącymi immunogenności oraz niezamierzoną lub niepełną odpowiedzią tkanek. W celu przezwyciężenia tych problemów od kilkudziesięciu lat stosuje się metody sieciowania. Sieciowanie odgrywa rolę w spowalnianiu biodegradacji, jak również w eliminowaniu lub zmniejszaniu odpowiedzi międzygatunkowej na białka strukturalne rusztowań ECM (Courtman et al., 2001).
Sukces sieciowania można docenić w rozwoju bioprotetycznych zastawek serca z tkanek ksenogennych. Odejście od obróbki formaldehydem i wprowadzenie sieciowania glutaraldehydem bioprotetycznych zastawek serca jest uważane za duże osiągnięcie w tej dziedzinie (Zilla i in., 2007). Usieciowanie pozwala zachować nietrombogenną powierzchnię bioprotetycznych zastawek serca, zmniejsza antygenowość i zapobiega degradacji, wydłużając tym samym ich żywotność in vivo. Ta forma utrwalania bioprotez zastawek serca jest stosowana do dziś. Garbowanie kolagenu chromem jest stosowane od ponad 100 lat w konserwacji skór zwierzęcych w przemyśle skórzanym (Covington, 1997). Proces ten obejmuje wiązania jonowe, kowalencyjne i wodorowe pomiędzy chromem a kolagenem. Ta forma stabilizacji biomateriału została również wykorzystana do produkcji katgutu chromowego jako materiału do szwów chirurgicznych (Van Winkle et al., 1975). Istnieją różne inne formy środków sieciujących, głównie opracowane z konieczności poprawy działania bioprotetycznych zastawek serca i tkanki osierdzia in vivo oraz przezwyciężenia niepowodzeń związanych ze zwapnieniem i cytotoksycznością. Środki sieciujące obejmują zarówno dobrze znane aldehydy (formaldehyd i glutaraldehyd), jak i nowsze dwufunkcyjne środki sieciujące, takie jak związki poliepoksydowe i diizocyjanian heksametylenu. Inne nowoczesne środki sieciujące obejmują środki sieciujące o zerowej długości, takie jak azydek acylowy i karbodiimidy (Khor, 1997). Chociaż sieciowanie aldehydem glutarowym jest nadal stosowane do stabilizacji rusztowań biologicznych, opracowywane są nowsze funkcjonalne i prawdopodobnie mniej cytotoksyczne metody sieciowania. Należą do nich enzym transglutaminaza mikrobiologiczna, związek ziołowy genipina oraz wielofunkcyjne sieciowanie dendrymeryczne (Garcia i in., 2007b; Duan i in., 2007; Chang i in., 2002; Chan i in., Obecnie odchodzi się od stosowania biodegradowalnych bioprotez, które mają przetrwać dłużej niż życie pacjenta, na rzecz biodegradowalnych rusztowań, które mają być przebudowywane in vivo w miarę upływu czasu w celu naprawy uszkodzonych lub chorych narządów (Brody i Pandit, 2007; Badylak, 2007). Degradacja rusztowań powinna być kontrolowana i zachodzić równolegle, aby odpowiadała tempu regeneracji tkanek in vivo (Burugapalli et al., 2007). Biodegradowalne rusztowanie stosowane w inżynierii tkankowej musi również zapewniać niezbędną funkcję do czasu, gdy nowo powstała tkanka może ją przejąć. W wyidealizowanym rusztowaniu biodegradowalnym, w miarę jak komórki gospodarza ingerują i zasiedlają wszczepione rusztowanie, wydzielają nową macierz zewnątrzkomórkową zastępującą oryginalne rusztowanie, które ulega degradacji w określonym tempie.
Wykazano, że tempo degradacji in vitro i in vivo rusztowania biologicznego może być dostosowane do stopnia usieciowania (Burugapalli i in., 2007). Liang i wsp. (2004) badali wpływ stopnia usieciowania na odpowiedź tkanki i wzorzec regeneracji, stosując acelularne osierdzie wołowe usieciowane genipiną. W modelu implantacji podskórnej u szczurów stwierdzono, że nieusieciowane i minimalnie usieciowane acelularne osierdzie bydlęce ulegało szybkiej degradacji przed utworzeniem się nowej tkanki. W przeciwieństwie do nich, w rusztowaniach umiarkowanie usieciowanych i wysoko usieciowanych obserwowano tworzenie się nowych kolagenów, choć w przypadku tych ostatnich proces ten był ograniczony do zewnętrznej warstwy rusztowania ze względu na jego większą odporność na degradację. Kiedy podobne rusztowania wszczepiono jako łatę naczyniową w modelu psim (Chang i in., 2004), na wewnętrznej powierzchni przeszczepu stwierdzono nienaruszoną warstwę śródbłonka, wraz z fibroblastami i komórkami mięśni gładkich gospodarza w przeszczepie acelularnym. Występowało to w mniejszym stopniu w acelularnym osierdziu wołowym sieciowanym glutaraldehydem, użytym w tym badaniu. W przypadku obu typów rusztowań zaobserwowano jednak niezamierzone pogrubienie błony wewnętrznej i metaplazję chondroidalną. W innym badaniu do naprawy uszkodzeń mięśnia sercowego w modelu prawej komory szczura użyto podobnego acelularnego osierdzia wołowego usieciowanego genipiną (Chang i in., 2005). Na powierzchni wsierdzia stwierdzono śródścienne zgrubienia pokryte komórkami śródbłonka. Komórki mezotelialne zaobserwowano również na zewnętrznych powierzchniach przeszczepu, które, jak się uważa, opierają się adhezji. Komórki mięśni gładkich, włókna neomięśniowe, neokolagen, neoglikozaminoglikany i neokapilary zaobserwowano w obrębie rusztowania po czterech tygodniach od implantacji.
Żelatyna została wykorzystana jako biomateriał do naprawy uszkodzeń nerwów obwodowych (Mligiliche i in., 1999; Gamez i in., 2004). Degradowalne rusztowania przygotowane z żelatyny i usieciowane genipiną zostały użyte jako materiał wypełniający w rurowej komorze silikonowej i służyły jako macierz pozakomórkowa do prowadzenia regeneracji nerwu przez 10 mm szczelinę nerwu kulszowego u szczurów (Liu i in., 2004). Wykazano, że pozostałości wypełnienia zapobiegały migracji i wydłużaniu się aksonów (Verdu i in., 2002), co miało wynikać z wydłużonego czasu degradacji żelatynowego wypełnienia (Bigi i in., 2002; Liu i in., 2004). Kiedy usieciowana żelatyna została użyta jako przewód rurowy (zamiast jako materiał wypełniający) do wypełnienia podobnych szczelin nerwowych, zregenerowane włókna nerwowe zawierające głównie niemyelinowane aksony z otaczającymi komórkami Schwanna zostały znalezione w poprzek szczeliny po sześciu tygodniach, kiedy przewód zaczął ulegać degradacji i nasiliła się neowaskularyzacja (Chen et al., 2005). W zewnętrznym obszarze zregenerowanego nerwu znajdowała się również gęsta tkanka bliznowata. Po implantacji podskórnej obserwowano cienką warstwę włóknistej kapsułki, wraz z oczekiwanymi ostrymi i przewlekłymi reakcjami zapalnymi.
Stwierdzono, że stężenie usieciowania dyktuje degradację in vivo, gdy usieciowane rusztowania żelatyna-fosforan trójwapniowy implantowano podskórnie (Yao i in., 2004). Mniej usieciowane rusztowanie wiązało się z większą degradacją, podczas gdy rusztowanie silnie usieciowane wykazywało minimalną degradację in vivo. Użycie większej ilości usieciowanego rusztowania wiązało się również ze zwiększonym tworzeniem włóknistej kapsuły implantu, co przypisywano cytotoksyczności usieciowanego rusztowania. Kiedy podobne rusztowania wszczepiono królikom w celu naprawy ubytków kostnych w kości łydkowej, autorzy stwierdzili, że rusztowania ulegały stopniowej degradacji i były zastępowane przez nową kość, chociaż proces ten był ograniczony tylko do interfejsu kość-ruszt (Yao i in., 2005). Ten sam kompozyt usieciowany aldehydem glutarowym wywołał podobną reakcję (Chen i in., 1998). W miarę upływu czasu następowała stopniowa degradacja rusztowania kompozytowego, w miarę jak rusztowania były zastępowane przez nową kość, a macierz acelularna odkładała się od krawędzi ubytku centrycznie. Podczas gdy rusztowanie inżynierskie może być kluczowe, inne czynniki mogą przyspieszyć proces gojenia. Na przykład, dodanie hiperbarycznej terapii tlenowej znacznie zwiększyło tworzenie się nowej kości, co wykazano za pomocą technik radiologicznych i histomorfometrycznych (Chen i in., 2004). Obecność czynników bioaktywnych, takich jak BMP-2 w degradowalnym rusztowaniu, indukowała ektopowe tworzenie kości podskórnie i domięśniowo i wydawała się przyspieszać resorpcję w wyniku działania osteoklastów (Liang i in., 2005; Takahashi i in., 2005; Kato i in., 2006; Yoneda i in., 2005).
.