Resultat och diskussion
Spirogyras konjugering har rapporterats induceras av sänkt kvävehalt eller utarmning (Grote 1977; Yamashita och Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Därför försökte vi först inducera konjugering genom att utarma kväve från odlingsmediet. Detta misslyckades dock. Grote (1977) rapporterade att konjugering inducerades i rent oorganiskt closteriummedium och att pH-värdet var viktigt. Trots att vi inkuberade algfilamenten i medium med olika pH-värden inducerades inte konjugationen. Dessutom misslyckades andra försök, olika temperaturer och utarmning av olika näringsämnen. Det har rapporterats att konjugering inducerades genom inkubation av algfilament under kontinuerlig belysning hos vissa arter av Spirogyra (Yamashita och Sasaki 1979). Våra material uppvisade dock ingen konjugering, inte ens när filamenten inkuberades utan kvävekälla under kontinuerlig belysning i två veckor. Efter ovan nämnda olika försök lyckades vi slutligen inducera konjugering genom att inkubera filament på agarplatta preparerad med APW vid 23°C under en 12:12-timmars L-D-cykel i 4 dagar. Stavformad rhizoid bildades också vid den distala änden av terminalcellerna under inkuberingen. När filamenten på agarplattan inkuberades i mörker inducerades inte konjugationsfenomenet. Allen (1958) har rapporterat att konjugering inducerades genom inkubation på agarplatta. Hon upprätthöll en stamkultur med Pringsheims jord-vattenmedium (Pringsheim 1946) under 16 timmars ljus (kylvitt lysrör)-8 timmars mörker vid ca 20 °C. För att inducera parning överfördes flera trådar till 1,5 % Difco-agar som framställts med destillerat vatten och inkuberades vid cirka 20 °C under en 16:8-timmars L-D-cykel. Efter några dagars inkubation bildades zygosporer på agarplattan. Även om ljusförhållandena och temperaturen under inkubationen var olika var Allens metod (1958) i grunden densamma som vår metod. Vi analyserade vidare de faktorer som är ansvariga för konjugationsinduktion på agarplattan enligt följande:
Vi undrade om någon eller några okända kontaminanter som fanns i agarpulvret var ansvariga för induktionen av konjugationen. Vi undersökte denna möjlighet genom följande experiment. Agarpulver (Wako, Osaka, Japan) suspenderades i APW och förvarades vid 4 °C under omrörning över natten. Efter centrifugering (185×g, 10 minuter) tvättades den resulterande pelletsen två gånger med APW genom centrifugering. Den slutliga agarpelleten suspenderades i ny APW och plattor förbereddes. Konjugationen inducerades framgångsrikt på denna agarplatta. När algfilamenten inkuberades i den supernatant som erhållits genom att tvätta agarpulvret inducerades ingen konjugering alls (data visas inte). Det var alltså inkubationen på agarplattan, men inte den lösliga kontaminanten, som var ansvarig för induktionen av konjugationen.
Då APW inte innehöll kvävehaltiga kemikalier bör agarplattan inte innehålla något eller mycket lite kväve. Därför var det möjligt att båda faktorerna, placering på agarplattan och utarmning av kväve, fungerade synergistiskt vid induktionen. För att undersöka denna möjlighet inkuberade vi filament på agarplatta som förberetts med APW kompletterat med 1 mM KNO3. På denna agarplatta inducerades också konjugering (fig. 1a), vilket tyder på att utarmning av kväve inte är orsaken till induktion av konjugering. Dessutom inducerades konjugering när filamenten inkuberades på en agarplatta som förberetts med closteriummedium, som innehöll olika näringsämnen (fig. 1b). Dessa resultat visade entydigt att placeringen på agarplattan i sig är en faktor som är ansvarig för induktion av konjugering.
Effekt av KNO3 och closteriummedium på start av konjugering på agarplatta. Ungefär 100 filament inkuberades på agarplattor som förberetts med APW, APW kompletterat med 1 mM KNO3 eller closteriummedium vid 23 °C under en L-D-cykel på 12:12 timmar under 4 dagar. När papilla observerades bedömde vi att cellen börjat konjugera. Resultaten presenterades som ett förhållande mellan antalet filament som började bilda konjugationsrör och det totala antalet filament. Experimenten upprepades tre gånger och data representeras som medelvärde och standard error of the mean (SEM)
Induktion av konjugation på agarplatta undersöktes hos andra arter, S.fuluviatilis, som differentierade rhizoid när man klippte av algfilamenten (data ej visad) som i fallet med S. castanacea. Hos denna art inducerades konjugering också vid inkubation på agarplattor som preparerats med APW. Vi undersökte vidare konjugationen på agarplatta hos tre Spirogyra, som inte differentierade rhizoid. S.ellipsospora Transeau har hållits i laboratoriet som en kontaminant i Chara-kulturer. Andra två Spirogyra sp. som samlats in från Biwa-sjön har hållits som axeniska kulturer i sex månader. Alla tre Spirogyra uppvisade ingen konjugering genom inkubation på agarplatta.
I vissa Spirogyra-arter inducerades konjugering genom sänkning eller utarmning av kväveinnehållet (Grote 1977; Yamashita och Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Förutom kvävehalten måste ljusintensiteten och/eller pH-värdet kontrolleras hos S. majuscule (Grote 1977). Hos S. castanacea och S. fuluviatilis var inkubation på agarplatta effektiv och utarmning av kväve var inte nödvändig (föreliggande studie). Å andra sidan rapporterade Agrawal och Singh (2002) att Spirogyra sp. inte startade konjugering på 2-10 % agarplatta. Detta liknade våra resultat som erhölls hos Spirogyra sp. som inte differentierade rhizoid. De faktorer som krävs för att inducera konjugering varierar alltså mycket mellan Spirogyra-arter. Vi undrade om det var tillväxthämning som låg bakom induktionen av konjugering på agarplattan. Under inkubering på agarplattor som framställts med antingen APW- eller closteriummedium förökade sig cellerna genom celldelning på båda agarplattorna när cellerna inte började bilda konjugationsrörets papiller. Hämning av tillväxten var således inte en utlösande faktor för konjugering.
För att undersöka förekomsten av parningstyp mellan filamenten utsattes monoklonala kulturer av S. castanacea för induktion av konjugering. Efter 48 timmars inkubation hittades två typer av konjugering i samma filament (fig. 2a-c). Figur 2b visar celler med inducerad skalariform konjugering (pilspets i figur 2a). I figur 2c visas å andra sidan celler som inducerar lateral konjugering (pil i figur 2a). Zygosporer bildades normalt efter den laterala konjugationen (fig. 2d). Yamagishi (1977) rapporterade att den skalarformiga konjugationen observeras i allmänhet, medan den laterala sällan observerades hos S.castanacea. Vårt resultat överensstämde med Yamagishis (1977). Inom en gräns för vår kunskap är dock induktion av både skalariform och lateral konjugering i samma filament (fig. 2a) den första rapporten. När två filament parades ihop uppträdde alla celler i det ena filamentet som hanar och cellerna i det andra filamentet som honor i de flesta fall. Mycket sällan bildades dock zygosporer i båda filamenten (fig. 3). Parningstypen är alltså inte fixerad åtminstone inte hos S.castanacea. Hypnozygot bildades genom inkubation på agarplattan i ca 1 månad. Det var dock svårt att reproducerbart inducera groning genom att tillsätta closteriummedium till dem. Metod för att reproducerbart inducera groning måste hittas.
Induktion av både skalarformiga och laterala konjugationer i samma filament. a Både skalarformiga och laterala konjugationer bildades i samma filament efter 48 timmars inkubation. b Högre förstoring av celler som visar scalariform konjugering i a (pilhuvud). c Högre förstoring av celler som visar lateral konjugering i a (pil). d Zygosporer som bildas via lateral konjugering efter 96 timmars inkubation. Staplar 50 μm
Konjugering i klonkultur. Efter 96 timmars inkubation på agarplatta bildades zygoter. Zygosporer bildades i båda filamenten. Bar 50 μm
Vi undersökte identifiering av extracellulära material som utsöndras under parningsprocessen med hjälp av olika lektiner i S. castanacea. Av 19 undersökta lektiner (BSL-I, BSL-II, Con A, DBA, DSL, ECL, jacalin, LEL, PHA-E, PHA-L, PNA, PSA, RCA I, SBA, SJA, STL, UEA I, VVL och WGA) färgade BSL-1, Con A, jacalin, RCA-I och SBA reproduktiva celler men inte vegetativa celler (tabell 1). Yoon et al. (2009) rapporterade att tre lektiner, Con A, RCA och UEA, visade betydande märkning av extracellulära material i S. varians (Hassall) Kützing. Lektinbindande material som utsöndras under konjugationen verkar alltså i viss mån skilja sig åt mellan olika arter. Vi har tidigare rapporterat att BSL-I och jacalin visade kontrasterande färgningsmönster i rhizoid: jacalin färgade tydligt rhizoidens kontur, medan färgningen med BSL-I var diffus (Inoue et al. 1999, Ikegaya et al. 2008b). Det föreslogs att det BSL-I-bindande materialet var ansvarigt för filamentens vidhäftning till substratet. Å andra sidan spekulerades det jacalinbindande materialet vara inblandat i erkännandet av substratet (Ikegaya et al. 2008b). I den aktuella studien riktade vi därför vår uppmärksamhet på BSL-I och jacalin (fig. 4). Efter 48 timmars inkubation på agarplatta bildade en filament som visas i fig. 4a papiller i olika riktningar. Det spekulerades att detta filament började bildandet av papiller i avsaknad av partnerfilamentet. BSL-I färgade starkt papillernas yta. Septa mellan cellerna var också starkt färgade. Därefter färgade vi ett par filament som började konjugera efter 48 timmars inkubation. I figur 4b bedömdes det att det övre filamentet var en hanlig gamet och att det undre var en kvinnlig gamet, eftersom diametern på de undre cellerna i filamentet blir större än diametern på det övre filamentet. Konjugationsrör som förlängdes från parcellerna var starkt färgade, medan hela cellytan hos den kvinnliga gameten var svagt färgad (fig. 4b′). Efter 72 timmars inkubation var hela cellytan på den hanliga gameten också svagt färgad (fig. 4c′). Efter 96 timmars inkubation på agarplatta bildades zygosporer (fig. 4d). Konjugationsrören var starkt färgade (fig. 4d′), medan zygosporernas yta inte var färgad. Därefter undersöktes färgning med jacalin. Cellerna i filamenten i fig. 3e bildade papiller i samma riktning. Vi spekulerade i att denna filament startade konjugationen i närvaro av en partnerfilament och att den förlorades under överföringen till objektglaset. Papillerna var starkt färgade med jacalin (fig. 4e′). Under hela konjugeringsprocessen färgade jacalin främst konjugeringskanalerna (fig. 4f′-h′). Färgningsmönstret med Con A, RCA-I och SBA undersöktes också (data visas inte). Con A färgade starkt septa mellan zygosporer som bildats i honliga gameter, medan papiller var mycket svagt färgade. När zygosporer bildades liknade färgningsmönstret med antingen RCA-I eller SBA det för BSL-I, vilket visas i figur 4d′.
Tabell 1
Undersökning av olika lektiner för bindning till vegetativa och reproduktiva celler hos Spirogyracastanacea
.
| Lektiner | Vegetativa celler | Reproduktiva celler | Specificitet |
|---|---|---|---|
| BSL-I | × | ○ | Gal α, GalNAc α |
| Con A | × | ○ | Man α, Glc α |
| Jacalin | × | ○ | Sialyl-Gal β1-3 GalNAc-O- |
| RCA I | × | ○ | Gal, GalNAc |
| SBA | × | ○ | GalNAc |
| WGA | × | × | (GlcNAc)n, sialinsyra |
Celler färgades (○), färgades inte alls (×)
Hållande av filament i processen för sexuell reproduktion med BSL-I och jacalin. Filament som inkuberades på agarplatta färgades med antingen fluoresceinmärkt BSL-I eller jacalin (a′-h′). Ljusfältsmikrofotografier visas också (a-h). a′-d′ färgning med BSL-I. Efter 48 timmars inkubering på agar bildades papiller i olika riktningar (a, a′), eller filament började konjugeras (b, b′). Konjugerade filament efter 72 timmars inkubation (c, c′). Efter 96 timmars inkubation bildades zygoter (d, d′). e′-h′ färgning med jacalin. Efter 48 timmars inkubation på agar bildades papiller i samma riktning (e, e′), eller så började filamenten konjugeras (f, f′). Konjugerade filament efter 72 timmars inkubation (g, g′). Efter 96 timmars inkubation bildades zygoter (d, d′). Bar 50 μm
Vi undersöker effekten av sex lektiner, BSL-I, Con A, jacalin, RCA-I, SBA och WGA, på konjugationen. Filamenten förinkuberades i APW kompletterat med någon av lektinerna under en dag. Därefter överfördes de till en agarplatta som kompletterats med samma lektin och inkuberades i 4 dagar. Det visade sig att jacalin allvarligt hämmade bildandet av zygosporer, medan andra inte gjorde det (data visas inte). Systematisk analys visade att jacalin allvarligt hämmade steget i början av papillbildningen (fig. 5). Därefter undersöktes reversibiliteten hos inhiberingen av jacalin. Filamenten inkuberades successivt i APW kompletterat med jacalin i 1 dag och sedan i APW utan jacalin i 1 dag. Därefter inkuberades de på en agarplatta utan jacalin i 4 dagar. Papiller bildades dock inte alls. Denna irreversibla hämning kan orsakas av jacalins starka bindning. Yoon et al. (2009) rapporterade att RCA och UEA hämmade konjugationen. De identifierade dock inte steget för hämmningen. Även om BSL-I, RCA-I, Con A och SBA också färgade konjugationsröret hämmade de inte bildandet av det. Rollerna för de material som känns igen av antingen BSL-I, RCA-I eller SBA är målet för framtida studier.
Effekt av lektiner på start av konjugationsrörsbildning. Ungefär 100 filament inkuberades i APW kompletterat med antingen 1 μg/ml BSL-I, Con A, jacalin, RCA-I, SBA eller WGA vid 23°C under en 12:12 h L-D-cykel i 1 dygn, och sedan överfördes de på agarplatta kompletterad med samma lektin och inkuberades i 4 dygn. När papilla observerades bedömde vi att cellen hade börjat konjugera. Resultaten representerades som ett förhållande mellan antalet filament som började bilda konjugationsrör och det totala antalet filament. Experimenten upprepades 4 gånger och data representeras som medelvärde och SEM
Randhawa (1959) föreslog likhet mellan konjugationsprocesserna och rhizoidbildningen: kontaktstimulans är inblandad. Å andra sidan ansåg Kniep (1928) att konjugationsprocesserna i huvudsak berodde på en kemisk stimulans (citerad i Randhawa (1959)). Både konjugationsröret och rhizoiden börjar med bildandet av en papilla och kan förlängas genom spetstillväxt. Konjugationsröret bildas dock vid flanken men rhizoid bildas vid cellens distala ände (Nagata 1973). Jacalin färgade tydligt konturerna av både konjugationsröret (fig. 3e′-h′) och rhizoid (Ikegaya et al. 2008b). Jacalin hämmade inte bildandet av rhizoid men hämmade differentieringen till rosettformad rhizoid (Ikegaya et al. 2008b). När det gäller konjugationsrör hämmade dock jacalin bildandet av papiller i sig (fig. 5). Det verkar som om det jacalinbindande materialets roll är olika i konjugationsrör och rhizoid.
Framgången med reproducerbar induktion av konjugation i laboratoriet öppnade en väg för systematiska analyser av konjugation i Spirogyra, som t.ex. bestämning av mekanismen för cellernas sexualitet, lektinbindande materialets roll, rörelsemekanismen för manlig protoplast.