Sie sind am Flughafen und müssen morgen früh einen Bericht für Ihren Professor schreiben. Sie haben Ihre Daten. Warum nutzen Sie nicht die Zeit und berechnen die Expressionsveränderung für die Gene, die Sie in Ihrem ersten qPCR-Experiment letzte Woche getestet haben?
Es ist ganz einfach – ich zeige Ihnen, wie es geht.
Prüfen Sie Ihre Methode
Es gibt zwei Hauptmethoden zur Analyse von qPCR-Daten: die Doppel-Delta-Ct-Analyse und die relative Standardkurvenmethode (Pfaffl-Methode). Beide Methoden beruhen auf Annahmen und haben ihre Grenzen, so dass die Methode, die Sie für Ihre Analyse verwenden sollten, von Ihrem Versuchsplan abhängt.
Die Doppel-Delta-Ct-Analyse geht davon aus, dass:
- die Primereffizienz zwischen den Primersätzen gleich ist (d. h. innerhalb von 5 %);
- die Amplifikationseffizienz der Referenz- und Zielgene liegt bei nahezu 100 %;
- die internen Kontrollgene werden konstant exprimiert und durch die Behandlung nicht beeinträchtigt.
Die Methode eignet sich im Allgemeinen für Experimente mit einer großen Anzahl von DNA-Proben und einer geringen Anzahl von zu testenden Genen.
Die Methode der relativen Standardkurve setzt voraus, dass:
- die Effizienz zwischen den Kontroll- und den behandelten Proben gleich ist.
Diese Methode funktioniert besser, wenn Sie weniger DNA-Proben, aber eine größere Anzahl von Genen zu testen haben.
Was Sie für die Double-Delta-Ct-Analyse benötigen
- qPCR-Ct-Werte (Rohdaten) für:
- das Housekeeping-Gen: Kontrolle und Versuchsbedingungen;
- das zu untersuchende Gen: Kontrolle und Versuchsbedingungen;
- eine Excel-Tabelle.
Und das ist alles! Keine teure Software erforderlich.
Hier eine kurze Zusammenfassung der wichtigsten Schritte der Doppel-Delta-Ct-Analyse (für eine ausführliche Erklärung lesen Sie dieses Papier).
4 Schritte für die Doppel-Delta-Ct-Analyse
1. Nehmen Sie den Durchschnitt der Ct-Werte für das Housekeeping-Gen und das zu testende Gen in den Versuchs- und Kontrollbedingungen und erhalten Sie 4 Werte. Die 4 Werte sind Experimentelles Gen (TE), Kontrolliertes Gen (TC), Experimentelles Haushaltergen (HE) und Kontrolliertes Haushaltergen (HC).
| Durchschnittlicher Experimenteller Ct-Wert | Durchschnittlicher Experimenteller Ct-Wert | Durchschnittlicher Kontroll-Ct-Wert | Durchschnittlicher Kontroll-Ct-Wert | \DeltaCt-Wert (Experimentell) | \DeltaCt-Wert (Kontrolle) |
|---|---|---|---|---|---|
| TE | HE | TC | HC | \DeltaCTE | \DeltaCTC |
| 21.27 | 20.23 | 19.60 | 19.27 | 1.03 | 0.33 |
2. Berechnen Sie die Differenzen zwischen den Versuchswerten (TE – HE) und den Kontrollwerten (TC – HC). Dies sind die \DeltaCt-Werte für die Versuchsbedingungen (\DeltaCTE) und die Kontrollbedingungen (\DeltaCTC).
3. Berechnen Sie dann die Differenz zwischen den \DeltaCT-Werten für die Versuchs- und die Kontrollbedingungen (\DeltaCTE – \DeltaCTC), um den doppelten Delta-Ct-Wert (ddCt) zu erhalten.
4. Da alle Berechnungen zur Logarithmusbasis 2 erfolgen, verringern sich die Ct-Werte jedes Mal, wenn doppelt so viel DNA vorhanden ist, um 1 und werden nicht halbiert. Sie müssen den Wert von 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} berechnen, um den Ausdruck „fold change“ zu erhalten.
| dCt-Wert (Experimentell) | dCt-Wert (Kontrolle) | ddCt-Wert | Expression Fold Change |
|---|---|---|---|
| dCTE | dCTC | ddCt | 2^-ddCt |
| 1.03 | 0,33 | 0,70 | 0,615572207 |
Was bedeutet der Wert?
Nun, da Sie Ihren Wert für die Fold Change haben, was bedeutet er eigentlich? Dieser Wert ist die fache Veränderung des Gens, das Sie interessiert, in der Testbedingung im Vergleich zur Kontrollbedingung, die alle auf Ihr Housekeeping-Gen normalisiert wurden.
Um es ein wenig deutlicher zu machen, können Sie sich den Wert als Prozentsatz vorstellen. Ein Fold-Change-Wert von 1 bedeutet, dass die Genexpression in der Testbedingung zu 100 % gleich hoch ist wie in der Kontrollbedingung – es gibt also keine Veränderung zwischen der Versuchsgruppe und der Kontrollgruppe. Ein Fold-Change-Wert über 1 zeigt eine Hochregulierung des betreffenden Gens im Vergleich zur Kontrolle an (1,2-fache Veränderung = 120 % Genexpression im Vergleich zur Kontrolle, 5 = 500 %, 10 = 1.000 % usw.). Werte unter 1 deuten auf eine Herabregulierung des Gens im Vergleich zur Kontrolle hin (eine Fold-Change von 0,5 entspricht einer Genexpression von 50 % im Vergleich zur Kontrolle, also einer halb so starken Expression wie in der Kontrolle usw.).
Sie können diese Daten als Fold-Change-Balkendiagramme darstellen, in denen die Kontrollbedingungen gleich 1 dargestellt werden. Sie können auch statistische Analysen verwenden, um die Signifikanz der Veränderungen zu überprüfen, z. B. mit einer Varianzanalyse (ANOVA) oder t-Tests, je nachdem, was für Ihren Versuchsaufbau geeignet ist!
Mit diesen Schritten können Sie Ihre qPCR-Analyse durchführen, wo immer Sie sind, selbst wenn Sie auf einer Reise sind. Um die Sache noch einfacher zu machen, können Sie eine Excel-Vorlage erstellen, die Sie jedes Mal verwenden können. Dann müssen Sie nur noch Ihre Daten eingeben und werden andere mit Ihrer Schnelligkeit bei der Durchführung von Analysen verblüffen!
Ursprünglich veröffentlicht am 9. Juli 2016. Überarbeitet und aktualisiert am 8. Februar 2021.
Further Reading
Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} Methode. Methods. 2001;25:402-8.
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